2017, Vol. 37 
2. 福建省天然化妆品工程研发中心, 厦门 361000;
3. 厦门上新日用化学制品有限公司, 厦门 361000;
4. 福建省道地药材生物工程重点实验室, 厦门 361000
2. Application Technique Engineering Center of Natural Cosmeceuticals, College of Fujian Province, Xiamen 361000, China;
3. XiamenShangxinDaily Chemical Products Co. Ltd., Xiamen 361000, China;
4. Fujian Provincial Key Laboratory of Genuine Regional Drug Bio-engineering, Xiamen 361000, China
应激反应是各种内外环境因素及社会、心理因素刺激作用于机体时，会出现的全身性非特异性适应反应。应激的最直接表现即精神紧张，脾虚肺热，精神疲乏，与过度应激诱导机体内源性炎症反应相关[1]。在内源性炎症发动的过程中，脂氧合酶（LOX）和一氧化氮（NO）起到重要作用。花生四烯酸经过LOX途径产生白三烯类（leukotrienes，LTs）炎性介质，参与炎症反应过程。而NO在体内由一氧化氮合酶催化左旋精氨酸而产生，具有广泛的生物学功能，是重要的细胞信号分子，同时还参与神经信息传递，心肺功能调节，细胞凋亡以及炎症反应，免疫防御等多个过程[2]。NO目前已知的有神经型、内皮型及诱生型，前两者又称为结构型，主要参与正常生理过程，维持细胞的正常生理功能。而诱生型NO由巨噬细胞内诱导性一氧化氮合酶催化产生，短期、大量的释放使巨噬细胞参与炎症反应[3]。适度的炎症反应，对于机体保护自身免受外环境的损伤，有着重要的意义，然而长期、过度的炎症反应会通过损伤DNA，抑制线粒体呼吸链、活性氮等细胞毒性效应介导细胞和组织的损伤[4]。中国药典表明太子参具有补益脾肺，益气生津，治肺虚咳嗽，脾虚食少，心悸，怔忡，水肿，消渴，缓解精神疲乏等作用，但具体药理作用机制仍不清[5]。本研究从抑制应激性损伤诱导的炎症反应方面探讨太子参的药理作用机制。
1 仪器与材料 1.1 仪器瑞士TecanSunrise多功能酶标仪（瑞士帝肯（Tecan）集团公司）；R-2000旋转蒸发仪（台湾台大（东莞）有限公司）；CO2超临界萃取仪（Jasco日本分光公司）；LE2002E电子天平（梅特勒托利多科学仪器有限公司）。
1.2 材料与试剂太子参购自福建省柘荣产区；乙醇购自景明化工股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO）（CAS号67-68-5，阿拉丁）；MTT（CAS号298-93-1，阿拉丁）；亚油酸（CAS号60-33-3，阿拉丁）；5-脂氧合酶（LOX-5）（CAS号JD-1443，上海晶都生物）；硝普钠（CAS号13755-38-9）、盐酸萘乙二胺（CAS号1465-25-4）、磷酸（CAS号7664-38-2）、磺胺（CAS号57-67-0）、半胱氨酸（CAS号52-90-4）、谷胱甘肽（CAS号70-18-8），国药集团化学试剂有限公司。
2 试验方法 2.1 太子参（福建省柘荣产区）的萃取 2.1.1 水加热回流萃取法将太子参粉末与水按1:（3~5）的比例进行加热回流萃取，经过5 000 r·min离心5 min后的上层液为太子参萃取液，再利用减压浓缩至膏状，得到不挥发成分介于10%（质量百分比）的水萃取物。
2.1.2 95%乙醇超声波萃取法将太子参粉末与95%乙醇按1:（5~8）的比例混合，每天以300 W超声波破碎机震荡30 min，第2天重复上述操作后过滤，得到第1份滤液。过滤后的残渣再重复同样程序，得到第2份滤液，2次滤液再经浓缩及冷冻干燥，即得醇萃取物。
2.1.3 超临界萃取法先取485 g太子参进行破碎前处理，超临界流体萃取条件为压力3.5×107 Pa，温度30 ℃，最后得到萃取液质量为13.8 g，得率2.8%，即得超临界萃取物。
2.2 MTT实验采用MTT评估萃取物对皮肤细胞是否具细胞毒性。将人类纤维母细胞株化细胞（1×104/孔）培养在96孔板，加入以DMSO配制的不同浓度（20 μg·mL-1、50 μg·mL-1和100 μg·mL-1）萃取物溶液，分别在37 ℃、5%CO2培养箱中培养至少24 h，移除旧的培养液，以PBS清洗1次，更换培养液，加入0.012 mol·L-1 MTT溶液10 μL，于细胞培养箱中作用4 h，移除培养液，加入100 μL的DMSO溶解沉淀物，震荡10 min，采用多功能酶标仪测定570 nm波长处吸光度[6]。
2.3 脂氧合酶活性抑制试验用DMSO将3种萃取物配制成50 μg·mL-1和100 μg·mL-1的溶液；取各浓度的3种萃取物溶液各1 μL，对照组取DMSO 1 μL，均加入LOX-5（135 U）2 μL，然后加入10 mol·L-1亚油酸1.5 μL作为反应底物，并加入Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）95.5 μL，混合均匀，静置反应3 min后，测定234 nm波长处吸光度[7]。
2.4 NO清除试验取0.005 mol·L-1硝普钠（NO供体）98 μL，分别加入用DMSO配制的质量浓度为50 μg·mL-1和100 μg·mL-1的3种萃取物溶液各2 μL，于25 ℃培养150 min，加入试剂1（0.1%盐酸萘乙二胺、5%磷酸和1%磺胺）100 μL，混合均匀后，测560 nm波长处吸光度[8]。
2.5 DNA保护功能评估pUC119 DNA是一个超螺旋结构（S-form）的质粒，经过UV或氧化伤害后，超螺旋结构会被打开成线形（L-form）。将不同浓度的太子参水提物或醇提物分别加入到pUC119 DNA质粒体系中，予以UVB+H2O2处理30 min，进行DNA凝胶电泳[9]。
3 结果与分析 3.1 太子参萃取物安全性评估以3种不同方法萃取得太子参萃取物，处理Hs68纤维母细胞24 h，MTT法评估萃取物对Hs68纤维母细胞增殖影响（表 1），结果显示随着3种不同萃取方法所得太子参萃取物浓度增加，Hs68纤维母细胞存活率随之下降，对细胞增殖的影响活性由强至弱的顺序为超临界萃取物、醇萃取物、水萃取物。与常用的细胞毒药物相比，3种不同萃取方法获得的太子参萃取物对Hs68纤维母细胞的增殖影响较弱，表明其应用安全性较高。
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表 1 太子参萃取物对Hs68纤维母细胞株之毒性影响 Table 1 The effect of Pseudostellaria heterophylla extracts on Hs68 fibroblast cell lines |
有研究表明复方太子参片可抑制小鼠炎症反应[10]。采用脂氧合酶抑制率及一氧化氮清除率实验进行抗炎功效评估，结果显示醇萃取物与水萃取物具有显著抑制脂氧合酶活性，而超临界萃取物则没有脂氧合酶活性抑制作用（表 2）。究其原因，与太子参的脂氧合酶抑制物主要为水溶性成分有关，因为超临界萃取法只能萃取极性低的成分，而水萃取和醇萃取法可以获取更多的太子参水溶性成分。NO也是炎症反应中的一个重要炎症介质，参与炎症反应的病理生理调控[11]。NO清除实验结果表明，3种太子参萃取物均具有显著的清除NO活性，与相同浓度的芦丁活性相当，NO清除活性由大至小的顺序为水萃取物、超临界萃取物、醇萃取物，表明NO清除与太子参非极性成分相关性更大。
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表 2 太子参萃取物抑制脂氧合酶（LOX-1）活性及清除NO能力评估 Table 2 The effect of Pseudostellaria heterophylla extracts on inhibition rate of lipoxygenase(LOX-1)activity and NO scavenging |
DNA严重的损伤会导致肿瘤的生成，因此天然抗氧化剂的研究越来越受到注目。过去的研究亦发现多种不同天然抗氧化剂有效保护DNA的裂解，如熊果酸、齐墩果酸、香草醛、姜黄等[12-13]，将安全性高及抗炎功效较好的水萃取物及醇萃取物进一步进行DNA保护能力评估，结果表明太子参水萃取物和醇萃取物均表现出一定的DNA保护作用，能减轻质粒DNA经过UVB和过H2O2损伤后的DNA断裂。醇萃取物的DNA保护作用强于水萃取物（图 1）。
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1.控制组pUC119 DNA（control pUC119 DNA）2. pUC119 DNA经UVB+H2O2处理（pUC119 DNA treated by UVB+H2O2）3. pUC119 DNA+太子参萃取物（50 μg·mL-1），经UVB+H2O2处理后（pUC119 DNA+extracts（50 μg·mL-1）treated by UVB+H2O2）4. pUC119 DNA+太子参萃取物（100 μg·mL-1），经UVB+H2O2处理后（pUC119 DNA+extracts（100 μg·mL-1）treated by UVB+H2O2） 图 1 太子参水萃取物（A）与醇萃取物（B）对DNA保护力评估 Figure 1 The evaluation of DNA protection ability with Pseudostellaria heterophylla extracts using water(A)and ethanol(B)extraction methods |
太子参具有不同的生理活性，也因此显现出广泛的药理功效，目前的研究多集中于太子参的水萃取物、醇萃取物及多糖类，利用水萃取方法获得的粗提物对于抗应激、抗疲劳及改善心肌梗死等，具有显着的功效[14-15]，而以醇萃取方法所得的粗提物则在增强免疫功能及抗氧化方面获得证实[14-15]。本研究针对其安全性进行评估测试，发现利用水萃取或醇萃取方法得到的萃取物质量浓度在50 μg·mL-1下，细胞存活率可达90%以上，表明太子参萃取物应用安全性高，毒性低，并且在此浓度下，太子参水萃取物或醇萃取物表现出良好的抗炎功效，与其抑制脂氧合酶活性和清除NO活性有关。太子参醇萃取物和水萃取物具有明显的DNA保护作用，表明其在炎症损伤的修复方面具有一定的辅助作用，可以对应激损伤诱导的炎症反应起到减轻损伤和促进损伤修复的双重作用，为太子参相关美容和保健品开发提供科学依据。
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