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  药物分析杂志   2017, Vol. 37 Issue (9): 1607-1614.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.09.09
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李丽莉, 吕轶峰, 朱雪妍. 葛根芩连片多成分含量测定的研究[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(9): 1607-1614. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.09.09.
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LI Li-li, LÜ Yi-feng, ZHU Xue-yan. Determination of multiple components in Gegen Qinlian tablets[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2017, 37(9): 1607-1614. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.09.09.
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第一作者

李丽莉, Tel:15977789644;E-mail:moli_tl@21cn.com。

通信作者

朱雪妍, Tel:13517686103, E-mail:384500662@qq.com

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收稿日期：2016-10-13
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
葛根芩连片多成分含量测定的研究
李丽莉 , 吕轶峰 , 朱雪妍     
广西壮族自治区食品药品检验所, 南宁 530021
收稿日期：2016-10-13
第一作者：李丽莉, Tel:15977789644;E-mail:moli_tl@21cn.com
通信作者：朱雪妍, Tel:13517686103, E-mail:384500662@qq.com
摘要：目的：建立葛根芩连片中14个特征性成分的HPLC含量测定方法，并测定11家生产企业的葛根芩连片含量。方法：采用Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5μm）反相高效液相色谱柱，以乙腈-0.02 mol·L-1醋酸铵+0.03%三乙胺溶液（用冰醋酸调pH4.3）为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，葛根素、大豆苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、大豆苷元、甘草酸铵、黄芩素8个成分检测波长250 nm，汉黄芩素检测波长280 nm，表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱5个成分检测波长346 nm。结果：葛根素、大豆苷、甘草苷、黄芩苷、汉黄芩苷、表小檗碱、盐酸药根碱、黄连碱、大豆苷元、盐酸巴马汀、甘草酸铵、盐酸小檗碱、黄芩素、汉黄芩素进样量分别在146.26~5850.24、24.13~965.04、18.45~738.00、79.18~3167.32、9.57~382.80、4.76~190.40、2.57~102.80、13.41~536.40、10.60~424.00、11.33~453.22、12.08~483.20、46.73~1869.25、20.28~811.20、12.11~484.50 ng范围内与峰面积呈良好线性关系（r>-10.9990）；平均加样回收率（n=6）分别为2.18%、1.79%、1.81%、1.68%、2.27%、2.13%、1.96%、1.07%、0.93%、0.61%、2.92%、0.77%、2.79%、0.62%；精密度、重复性、稳定性良好，RSD均小于3%。用该方法测定11家生产企业生产的16批葛根芩连片，除一批样品的汉黄芩苷未被检出外，其余企业14种成分均有检出，但含量存在差异。结论：该方法准确易行，可用于该品种的整体质量控制。
关键词：葛根芩连片    葛根素    大豆苷    甘草苷    黄芩苷    汉黄芩苷    表小檗碱    盐酸药根碱    黄连碱    大豆苷元    盐酸巴马汀    甘草酸铵    盐酸小檗碱    黄芩素    汉黄芩素    高效液相色谱    
Determination of multiple components in Gegen Qinlian tablets
LI Li-li, LÜ Yi-feng, ZHU Xue-yan    
Guangxi Institute for Food and Drug Control, Nanning 530021, China
Abstract: Objective: To establish an HPLC method for simultaneous determination of fourteen index components in Gegen Qinlian tablets and perform the quantitative analysis on Gegen Qinlian tablets from eleven pharmaceutical companies.Methods: RP-HPLC separation was carried on an Inertsil ODS-3 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)with the mobile phase consisting of acetonitrile and ammonium acetate+0.03% triethylamine aq.(adjusting pH to 4.3 by acetic acid)with a gradient elution at the flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 250 nm for puerarin, daidzin, liquiritin, baicalin, wogonoside, daidzein, ammonium glycyrrhizinate and baicalein, at 280 nm for wogonin, and at 346 nm for epierberine, jatrorrhizine hydrochloride, coptisine, palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride.Results: Good linear correlations(r>-10.999 0) were found in the range of 146.26-5 850.24 ng, 24.13-965.04 ng, 18.45-738.00 ng, 79.18-3 167.32 ng, 9.57-382.80 ng, 4.76-190.40 ng, 2.57-102.80 ng, 13.41-536.40 ng, 10.60-424.00 ng, 11.33-453.22 ng, 12.08-483.20 ng, 46.73-1 869.25 ng, 20.28-811.20 ng, 12.11-484.50 ng for puerarin, daidzin, liquiritin, baicalin, wogonoside, epierberine, jatrorrhizine hydrochloride, coptisine, daidzein, palmatine hydrochloride, ammonium glycyrrhizinate, berberine hydrochloride, baicalein and wogonin, respectively. The average recoveries(n=6)of the fourteen components were 2.18%、1.79%、1.81%、1.68%、2.27%、2.13%、1.96%、1.07%、0.93%、0.61%、2.92%、0.77%、2.79%、0.62%, respectively. The accuracy, precision and stability were satisfactory with RSD values less than 3%. Sixteen batches of Gegen Qinlian tablets from eleven pharmaceutical companies were investigated. Wogonoside was not founded in one batch and all the fourteen components were detected in the rest samples but their contents varied.Conclusion: The established method was accurate and feasible, which could be applied in comprehensive quality control of Gegen Qinlian tablets.
Key words: Gegen Qinlian tablets    puerarin    daidzin    liquiritin    baicalin    wogonoside    epierberine    jatrorrhizine hydrochloride    coptisine    daidzein    palmatine hydrochloride    ammonium glycyrrhizinate    berberine hydrochloride    baicalein    wogonin    HPLC    

近年来，随着对中药复方制剂质量标准研究的不断深入，医药工作者越来越意识到中药复方制剂的功效是药品内含成分整体作用的体现，是多种成分、多种机制的综合作用的结果，仅仅凭借以某一化学成分为对照的定性和定量的中药质量控制方法，不能真正反映中药的内在综合质量，因此提出了中药整体控制模式[1-2]。

葛根芩连制剂来源于《伤寒论》中葛根芩连汤，方中以葛根为主，既能清热解表，又能升发脾胃清阳之气而治下痢；辅以黄芩、黄连苦寒之品以清胃肠之湿，使以甘草清热解毒，调和诸药[3-5]。目前葛根芩连制剂有片、丸（微丸）、胶囊、颗粒4种剂型，而葛根芩连片是生产厂家最多，临床应用最广的剂型。

葛根芩连制剂中4味中药化学基础均较清楚：葛根的主要活性成分为大豆苷、大豆苷元、葛根素等黄酮类和皂苷类化合物；黄芩的主要活性成分为黄芩苷元、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素等黄酮类化合物；黄连的主要活性成分为小檗碱、巴马汀、黄连碱、药根碱、表小檗碱等生物碱；甘草的主要活性成分为甘草酸、甘草次酸、甘草苷、甘草苷元等皂苷类和黄酮类化合物[4-5]。目前，对葛根芩连制剂的整体质量控制的研究多集中在葛根芩连汤上，且多为HPLC法同时测定多种有效成分[6-8]，其中章军等[7]建立了葛根芩连汤中12种有效组分的三波长同时测定HPLC方法，毛莹等[8]建立了葛根芩连汤中14种药效组分的单波长HPLC方法。对葛根芩连片的整体质量控制仅见胡晓茹等[9]建立了葛根芩连片的指纹图谱并指认了8个特征峰。

本研究采用HPLC法同时测定多种有效成分的方式，对葛根芩连片的整体控制方法进行探索性研究，并比较11个不同生产企业共16批葛根芩连片中特征成分的含量差异。共选取了文献报道[4-5]的14个特征性成分，其中，葛根的指标成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元，黄芩的指标成分为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，黄连的指标成分为表小檗碱、药根碱（以盐酸药根碱计）、黄连碱、巴马汀（以盐酸巴马汀计）、小檗碱（以盐酸小檗碱计），甘草的指标成分为甘草苷、甘草酸（以甘草酸铵计），采用250、280、346 nm 3个波长同时测定，为葛根芩连片的整体质量控制提供了科学依据。

1 仪器、试剂与样品

Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器，UWD紫外检测器。德国Elma S180H超声清洗器。MILLI-PROA纯水处理器。日本GL Science Inc. Inertsil ODS-3 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）。

对照品葛根素（含量测定用，批号：110752-200912，含量96.0%）、大豆苷（含量测定用，批号：110738-201302，含量91.3%）、甘草苷（含量测定用，批号：111610-200604）、黄芩苷（含量测定用，批号：110715-201117，含量91.7%）、盐酸药根碱（含量测定用，批号：110733-200806）、大豆苷元（含量测定用，批号：1502-200101）、盐酸巴马汀（含量测定用，批号：110732-200907，含量为86.1%）、甘草酸铵（含量测定用，批号：110731-200512）、盐酸小檗碱（含量测定用，批号：110713-201212，含量为86.7%）、黄芩素（含量测定用，批号：111595-200402）、汉黄芩素（批号：1514-200202）等由中国食品药品检定研究院提供，对照品汉黄芩苷（批号：A0595）、表小檗碱（批号：A0627）、黄连碱（批号：201201RS）由云南特法特生物科技有限公司提供，含量均为100%。

乙腈为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

葛根芩连片样品为市售样品，11个不同生产厂家的样品分别被命名为A~K，其中A厂样品用于方法学考察。阴性对照样品为自制。

2 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相、流速见表 1；柱温：35 ℃；检测波长见表 2；进样量：10 μL。

表 1 流动相梯度洗脱条件 Table 1 Gradient programme of mobile phase

表 2 混合对照品溶液制备及测定波长 Table 2 The preparation of mixed standard solution and the detection wavelengths of the components
3 溶液的制备 3.1 混合对照品溶液

精密称取对照品适量，加甲醇制成每1 mL含葛根素150 μg、大豆苷25 μg、大豆苷元10 μg、黄芩苷80 μg、汉黄芩苷40 μg、黄芩素10 μg、汉黄芩素10 μg、巴马汀15 μg、小檗碱50 μg、甘草苷20 μg、甘草酸铵10 μg、黄连碱15 μg、药根碱2.5 μg、表小檗碱5 μg的混合对照品溶液，即得。具体数据见表 2。

3.2 供试品溶液

样品研细，取约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，称量，加热回流30 min，放冷，再称量，用70%甲醇溶液补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.3 阴性样品溶液

按葛根芩连片处方、制法项下方法制成分别不含葛根、黄芩、黄连、甘草的阴性样品。分别取缺葛根、黄芩、黄连、甘草等的阴性样品，按“3.2”项下方法制备。

4 方法学考察 4.1 专属性

取“3”项下各溶液，按“2”项下条件进行测定，结果在各自对应的成分上相应的保留时间几乎无吸收峰，表明处方中其他成分对测定无干扰。见图 1。

1.葛根素（puerarin）2.大豆苷（daidzin）3.甘草苷（liquiritin）4.黄芩苷（baicalin）5.汉黄芩苷（wogonoside）6.表小檗碱（epierberine）7.盐酸药根碱（jatrorrhizine hydrochloride）8.黄连碱（coptisine）9.大豆苷元（daidzein）10.盐酸巴马汀（palmatine hydrochloride）11.甘草酸铵（ammonium glycyrrhizinate）12.盐酸小檗碱（berberine hydrochloride）13.黄芩素（baicalein）14.汉黄芩素（wogonin） 图 1 对照品（A）、样品（B）、缺葛根阴性样品（C）、缺甘草阴性样品（D）、缺黄连阴性样品（E）、缺黄芩阴性样品（F）HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A), sample(B), negative sample lank of Puerariae lobatae radix(C), negative sample lank of Glycyrrhizae radix et rhizoma(D), negative sample lank coptidis rhizome(E)and negative sample lank of Scutellariae radix(E)
4.2 线性关系考察

精密取“3.1”项下的混合对照品溶液注入液相色谱仪，进样量分别为1、5、10、20、30、40 μL。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，回归方程与线性范围见表 3。

表 3 方法学考察数据 Table 3 Results of methodology validation
4.3 重复性试验

取同一批样品（A厂，批号20120502），按“3.2”项下方法平行制备6份溶液，按“2”项下条件测定，结果表明，本法的重复性较好，见表 3。

4.4 精密度试验

取“4.3”项下的同一份溶液，按“2”项下条件，连续测定6次。结果各成分峰面积的RSD均小于3%（n=6），试验表明，本法的精密度较好，见表 3。

4.5 稳定性试验

取“4.3”项下的同一份溶液，按“2”项下条件，分别于0、6、11、17、23 h测定，结果各成分峰面积的RSD均小于3%（n=6），试验表明，本法的精密度较好，见表 3。

4.6 加样回收率试验

取样品约0.125 g（A厂，批号20120502），共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入“3.1”项下的混合对照品溶液25 mL，称量，分别加热回流30 min，放冷，再称量，用70%甲醇溶液补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样测定，计算回收率，结果见表 4。

表 4 14个成分的加样回收率（n=6） Table 4 Recoveries of the fourteen components
5 样品测定

对11个葛根芩连片生产企业的16批样品，按“3.2”项下方法制备，按“2”项下条件进行测定，结果见表 5。

表 5 样品测定结果（mg·g-1，n=6） Table 5 Results of sample determination
6 讨论 6.1 色谱条件的选择 6.1.1 流动相的选择

参考有关文献[6-12]，分别以A[乙腈-0.05%磷酸二氢钾+0.05%三乙胺溶液（磷酸调节pH至3.0）]、B[乙腈-0.5%磷酸溶液]、C[乙腈-甲醇-0.5%磷酸溶液]、D[乙腈-0.02 mol·L-1醋酸铵+0.03%三乙胺溶液（用冰醋酸调pH4.3）]、E[乙腈-0.02 mol·L-1醋酸铵+0.03%三乙胺溶液（用冰醋酸调pH 4.3）]共5种流动相进样分析，经摸索以流动相E进行梯度洗脱分离效果最佳。

6.1.2 测定波长的选择

参考中国药典2010年版以及文献[6-12]，选择250、280、346 nm 3个波长作为测试波长，测定“3.1”项下的混合对照品溶液，经对比确定各成分的测定波长如表 2所示。

6.2 提取条件的考察 6.2.1 提取溶剂的考察

考察50%乙醇、70%乙醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇溶液和甲醇6种溶剂，70%甲醇溶液对14种对照品的提取效率最高。

6.2.2 提取方法的考察

考察了超声处理（功率320 W，频率40 kHz）和加热回流2种方式，在相同时间内加热回流效率更高。

6.2.3 提取时间的考察

考察了加热回流15、30、60 min时的提取效率，加热回流30 min，样品中各成分已经提取完全。

6.2.4 提取溶剂的用量考察

分别用20、25、50 mL 70%甲醇溶液提取，结果提取溶剂为25 mL时各成分已经提取完全。

6.3 未完全分离峰的积分方式

本研究中表小檗碱和盐酸药根碱未能完全分离，分离度为1.0，积分时采用安捷伦色谱工作站垂线分离的积分方式。

6.4 讨论

通过对11个厂家16批样品的测定，发现各批次中葛根、黄连、黄芩和甘草中所含指标性成分均有检出，提示各企业均按规定投入相应药味。但各指标性成分均存在一定差异，进一步说明了开展中成药整体控制，多种成分同时测定比用单一指标成分控制中成药质量更可靠。

由于黄芩苷和汉黄芩苷的水解产物为黄芩素、汉黄芩素，故应以4个成分的总量来控制黄芩的质量。从各厂家的数据发现，黄芩中所含的成分各厂家差异显著，以黄芩中的主要成分黄芩苷为例：含量最高的为26.56 mg·g-1（F厂，批号130928），含量最低的仅为0.80 mg·g-1（G厂）相差30倍，黄芩的其他成分黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷各样品之间差异也十分显著。究其原因，除制剂过程中工艺控制的差异导致各企业产品差异外，也有可能为投料的差异所致。传统认为河南承德是黄芩的道地产地，现今内蒙、山西、吉林、云南、四川等均有黄芩出产。据文献报道[13-14]，不同产地的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等有效成分差异显著，野生黄芩与栽培黄芩有效成分也各有高低，为了更好地控制药品的质量，保证药品的安全有效，建议加强对葛根芩连片中黄芩的含量控制。

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