2017, Vol. 37 
参益安神片是由人参、酸枣仁，五味子等药材，在临床经验指导下，通过现代化的制剂工艺研制而成，是一种具有安神促智功效的中药复方制剂。人参、酸枣仁和五味子都具常用作复方制剂的中药材[1]，其中人参皂苷Rb1具有增强学习记忆能力、认知能力等促智作用[2]；酸枣仁皂苷类化学成分具有镇静催眠的药理作用[3]；五味子木脂素类化学成分具有明显的镇静催眠、保护脑神经以及改善认知的作用[4]。
近年来，中药复方制剂的质量评价与控制得到了足够的重视，多种成分同时测定与对照品替代法也逐渐成为国内前沿科研课题之一[5-12]。本实验利用DAD检测器程序可切换波长的特性，分别在各成分紫外最大吸收波长处进行扫描，并设双标准物质进行检测，同时结合现已广泛应用的一测多评法[13-17]，将3种检测技术融为一体，建立了一种可靠便捷的含量测定方法，以控制参益安神片的质量。
1 仪器与试药Agilent 1260 HPLC仪（四元泵、100 μL自动进样器、DAD检测器）；Purifier超纯水机。色谱柱Hypersil ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）。样品（参益安神片）自制（批号160101、160102、160103、160105、160105、160106），对照品人参皂苷Rb1（批号110704-201424）、酸枣仁皂苷A（批号110734-201512）、五味子醇甲（批110857-201513）、五味子甲素（批号110764-201513）、五味子乙素（批号110765-201512）均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。人参、酸枣仁、五味子、益智仁均购自长春市宏检大药房，由长春中医药大学蔡广知老师鉴定，符合中国药典2015年版之规定。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Hypersil ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，柱温30 ℃；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0~20 min，21%A；20~33 min，21%A~34%A；33~45 min，34%A；45~62 min，34%A~51%A；62~90 min，51%A~70%A），流速：1 mL·min-1；检测波长：203 nm（检测人参皂苷Rb1、酸枣仁皂苷A）、217 nm（检测五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素）；进样量：10 μL；程序可变检测波长0~45 min为203 nm，45~90 min为217 nm。
2.2 程序可变波长的选择由三维图谱扫描可得到参益安神片中5种有效成分的最佳吸收波长，见图 1。
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A.空白试剂（blank reagent）B.人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）C.酸枣仁皂苷A（Jujuboside A）D.五味子醇甲（schisandrin）E.五味子甲素（deoxyschizandrin）F.五味子乙素（γ-schizandrin） 图 1 参益安神片5种成分三维图谱扫描结果 Figure 1 3D spectra of five components in Shenyi Anshen tablets |
由图 1可知，人参皂苷Rb1和酸枣仁皂苷A为紫外末端吸收，对照空白谱图，排除溶剂干扰，选择203 nm为这2种有效成分的最佳吸收波长；五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素均在217 nm处呈现出最大吸收。最终综合各组分出峰时间和最佳吸收波长得出选择结果如表 1，即0~45 min为203 nm，45~90 min为217 nm。
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表 1 参益安神片中5种有效成分波长的选择 Table 1 Wavelength selection for five components in Shenyi Anshen tablets |
精密称取对照品人参皂苷Rb1、酸枣仁皂苷A、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素2.5、0.8、0.73、0.3、0.05 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度分别为0.25、0.08、0.073、0.03、0.005 mg·mL-1的混合对照品溶液，备用。
2.3.2 供试品溶液取参益安神片10片，精密称定，研细混匀，精密称取1.8 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，密塞，超声（功率250 W，频率33 kHz）处理30 min，滤过，滤液通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为2 cm，柱长为10 cm），用10%和75%的乙醇水溶液各60 mL洗脱，收集75%乙醇水洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.3 阴性对照溶液按照参益安神片处方工艺，分别制备缺人参，缺酸枣仁和缺五味子的阴性样品，按“2.3.2”项下方法制备阴性对照溶液。
2.4 方法学考察 2.4.1 系统适应性试验精密吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图 2。
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1.人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）2.酸枣仁皂苷A（Jujuboside A）3.五味子醇甲（schisandrin）4.五味子甲素（deoxyschizandrin）5.五味子乙素（γ-schizandrin） 图 2 混合对照品（A）、参益安神片供试品（B）、缺人参供试品（C）、缺五味子供试品（D）及缺酸枣仁供试品（E）的HPLC色谱图 Figure 2 The HPLC chromatogram of mixed reference substances (A), Shenyi Anshen tablets (B), negative sample lack of Ginseng Radix et Rhizoma (C), negative sample lack of Schisandrae Chinensis Fructus (D) and negative sample lack of l Ziziphi Spinosae Semen (E) |
供试品色谱图中，人参皂苷Rb1、酸枣仁皂苷A、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的保留时间与相应对照品图一致，与其相邻色谱峰的分离度均＞1.5。
2.4.2 线性关系考察取混合对照品溶液，分别进样1、2、4、8、12、14 μL，记录色谱图，计算峰面积值。以测得的响应信号（峰面积）和被测物的进样量（μg），用最小二乘法进行线性回归，得到各成分的回归方程以及线性范围。结果表明：各有效成分对照品在如下范围内呈良好的线性关系，见表 2。
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表 2 参益安神片各有效成分的线性关系 Table 2 The linear relationship of the effective components in Shenyi Anshen tablets |
取同一份参益安神片供试品溶液，连续进样6次，测定人参皂苷Rb1、酸枣仁皂苷A、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素5个成分的峰面积，计算RSD。结果各成分峰面积的RSD分别为0.63%、0.40%、1.03%、0.73%、1.65%，均小于3%，表明仪器的精密度良好。
2.4.4 稳定性试验取同一份参益安神片供试品溶液，分别于样品制备后的0、2、4、8、12、18、24 h进样，测定峰面积，计算RSD。结果参益安神片中人参皂苷Rb1、酸枣仁皂苷A、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素5个成分峰面积的RSD分别为1.36%、1.30%、1.23%、1.52%、1.66%，表明24 h内供试品溶液的稳定性良好。
2.4.5 重复性试验取同一批样品6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录各成分峰面积，计算RSD。结果参益安神片中人参皂苷Rb1、酸枣仁皂苷A、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素5个成分峰面积的RSD分别为0.73%，1.33%，1.48%，1.25%，1.64%，表明该方法重复性良好。
2.4.6 加样回收率试验精密称取重复性试验测定项下已知含量的参益安神片样品6份，分别精密加入与相应的样品中待测成分的量相当的对照品，按“2.3.2”项下方法制备供试溶液并进样测定，记录各成分峰面积积分值，计算回收率及其RSD，结果如表 3，表明本法准确度较好。
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表 3 加样回收率（n=6） Table 3 Recoveries(n=6) |
取混合对照品溶液1、2、4、8、12、14 μL进样测定，以人参皂苷Rb1和五味子醇甲为内参物，分别计算酸枣仁皂苷A，五味子甲素和五味子乙素的相对校正因子，结果见表 4。
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表 4 参益安神片中3种有效成分的相对校正因子 Table 4 The relative correction factor of 3 active ingredients in Shenyi Anshen tablets |
利用相对保留值（rk/s）定性，测得酸枣仁皂苷A、五味子甲素和五味子乙素的相对保留值（rk/s）结果，见表 5。RSD≤2%，表明利用相对保留值（rk/s）进行色谱峰定位准确可行。
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表 5 不同仪器和色谱柱测得的相对保留值（rk/s） Table 5 Relative retention values(rk/s) measured by different instruments and columns |
rk/s=tR（k）/tR（s），k为待测组分，s为对照物。
2.5.3 相对校正因子耐用性考察按照上述方法，对参益安神片中的3种成分校正因子进行耐用性考察，结果见表 6~9。可见参益安神片中各成分相对校正因子是相对稳定的数值，可用于定量分析。
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表 6 不同色谱柱对相对校正因子的影响 Table 6 The influence of different columns on the relative correction factor |
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表 7 不同色谱仪对相对校正因子的影响 Table 7 The influence of different instruments on relative correction factor |
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表 8 不同柱温对相对校正因子的影响 Table 8 The influence of different column temperature on relative correction factor |
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表 9 不同流速对相对校正因子的影响 Table 9 The influence of different flow rates on relative correction factor |
分别精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液各10 μL注入高相液相色谱仪，依法测定，分别采用外标法和双标法进行计算，并对2种方法测定结果进行比较，结果见表 10。
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表 10 外标法与双标法结果比较（mg·g-1） Table 10 Comparison of results determined by external standard method(ESM) and dual markers method (DMM) |
本试验考察了提取溶剂、提取次数、提取方式和纯化方式等因素。结果表明：甲醇超声处理30 min，提取液过D101型大孔树脂，收集75%乙醇水洗脱液浓缩的前处理方法，能够高效地提取分离出待测的5种成分。
3.2 内标物质的选择本实验曾分别以人参皂苷Rb1、酸枣仁皂苷A、五味子醇甲和五味子甲素作为内标物，建立双标法，计算各成分的含量。结果表明，选用人参皂苷Rb1和五味子醇甲作为内标物时与外标法的结果误差最小。参照一测多评法建立的技术指南[16]，内标物尽量选择出峰时间居中，且含量较高的有效成分，本文确定选用人参皂苷Rb1和五味子醇甲作为内标物，且两者的化学对照品具有较易获得，价格相对低廉等优点，亦适宜作为内标物。
综上所述，本试验建立的程序可变波长双标法应用于参益安神片的含量测定便捷、可靠，为控制参益安神片质量提供了参考方法。同时本试验利用人参皂苷和酸枣仁皂苷母核化学结构的相似性，以人参皂苷Rb1为内参物检测酸枣仁皂苷A；更借助程序可变波长法，实现了不同药材的不同成分同时检测的含量测定方法，为日后中药复方制剂的质量控制提供了一个新的思路。
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