2017, Vol. 37 
2. 北京同仁堂股份有限公司科学研究所, 北京 100079
2. Research Institute of Beijing Tongrentang Shareholding Co. Ltd, Beijing 100079, China
白术为菊科植物白术（Atractylodes macrocephala Koidz）的干燥根茎，《神农本草经》将其列为上品，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎功效，中国药典2015年版一部收载白术及麸炒白术2种饮片品种[1]，土白术及焦白术炮制品种收载于《北京市中药饮片炮制规范》2008年版。现代研究表明白术中含多类化学成分，包括挥发油、内酯、多糖、氨基酸等，其中挥发油及内酯类成分为白术主要药效成分[2-4]。目前多见以挥发油类[5, 6]、内酯类[7-12]化合物作为质控指标控制白术质量的报道，如尹华等[13]、闫晗等[14]采用波长切换技术建立同时测定白术中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和苍术酮等多成分含量的HPLC-DAD分析方法。但是由于白术挥发油对照品稳定性差，内酯类化合物对照品价格昂贵，导致白术质量控制研究仍存在一定困难。
为降低白术质量控制成本，优化白术含量测定方法，本研究按照文献[15]的技术要求，以丹皮酚为内标物质，采用HPLC法建立了4种白术饮片中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及苍术酮的“一测多评”的HPLC含量测定方法。研究结果表明，所建立的方法简便、准确、可靠，可用于白术的质量控制。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent Technologies 1260 infinity型高效液相色谱仪；Agilent 1290A型高效液相色谱仪；ThermoFisher UltiMate®3000高效液相色谱仪；Waters e2695-2489型；Sartorius CP225D电子分析天平；SB25-12D型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
色谱柱Phenomenex®Gemini 5 μ C18 110A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm 5 μm）；Techmate C18-STⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm）。
1.2 试药丹皮酚（批号：0708-9704）由中国食品药品检定研究院提供；白术内酯Ⅰ（批号：2013D1RS）、白术内酯Ⅱ（批号：2013D1RS）、白术内酯Ⅲ（批号：2013D1RS）由云南特法特生物科技有限公司提供；苍术酮（批号：130329）由成都普菲德生物技术有限公司提供，纯度均大于98%；白术对照药材（批号：120925-200708）由中国食品药品检定研究院提供。白术、麸炒白术、土白术、焦白术饮片经北京市药品检验所陶志国鉴定，由A~J共10个厂家提供。
乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果 2.1 方法学验证 2.1.1 色谱条件采用色谱柱Kromasil 100-5C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-水溶液（B），梯度洗脱（0~6 min，40%A；6~7 min，40%→55%A；7~12 min，55%→33%A；12~13 min，55%→68%A；13~20 min，68%A；20~21 min，68%→80%A；21~25 min，80%→85%A；25~26 min，85%→90%A；26~40 min，90%A；40~40.01 min，90%→40%A），流速1 mL·min-1，检测波长为切换波长（0~21 min，220 nm；21~25 min，276 nm；25~40 min，200 nm），柱温35 ℃。在上述条件下，各组分分离度良好，见图 1。
|
1.丹皮酚（paeonol）2.白术内酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ）3.白术内酯Ⅰ（atractylenolideⅠ）4.白术内酯Ⅱ（atractylenolide Ⅱ）5.苍术酮（atractylone） 图 1 对照品（A）、样品（B）及不含丹皮酚样品（C）HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A), sample (B)and sample without paeonol (C) |
精密称取丹皮酚、白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及苍术酮适量，加甲醇配制成质量浓度分别为10.27、7.456、5.97、18.44、44.37μg·mL-1的混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液制备取本品细粉（过6号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 mL、丹皮酚对照品溶液（质量浓度为41.08 μg·mL-1）5 mL，称量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。
2.1.4 测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下条件测定，以丹皮酚对照品的峰面积为对照，利用相对校正因子分别计算白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和苍术酮的含量，用待测成分色谱峰与丹皮酚色谱峰的相对保留时间确定，其相对保留时间应在规定值的±5%范围之内，即得。相对保留时间及相对校正因子见表 1。
|
表 1 5种对照品的相对保留时间及相对校正因子 Table 1 The relative retention time and relative correcting factors of five reference substances |
精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液各1、2、4、6、8、10、12、15、20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以各对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，各成分回归方程及线性范围见表 2。
|
|
表 2 4种对照品回归方程和线性范围 Table 2 The linear relationship and range of four reference substances |
取同一供试品溶液，连续测定6次，以相应丹皮酚与白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、苍术酮色谱峰的峰面积的比值计算RSD，结果分别为0.75%、0.42%、0.64%、0.29%。
2.1.7 重复性试验取同一批次样品（厂家F）细粉末，按照“2.1.3”项下方法，平行制备6份溶液，测定并计算含量。结果白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、苍术酮的平均含量分别为0.385、0.378、0.659、15.6 mg·g-1，RSD分别为0.59%、1.13%、0.84%、1.10%。
2.1.8 稳定性试验取同一供试品溶液（厂家F），分别在1、2、4、8、12、24、48 h进样测定，结果白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、苍术酮的RSD分别为0.38%、0.30%、0.37%、0.21%，表明白术供试品溶液在48 h内稳定。
2.1.9 加样回收试验精密称取已知含量的同一批次样品（厂家F，测定前按四分法取样，粉成细粉）（白术内酯Ⅰ含量为0.385 1 mg·g-1，白术内酯Ⅱ含量为0.377 8 mg·g-1，白术内酯Ⅲ含量为0.658 7 mg·g-1，苍术酮含量为15.59 mg·g-1）0.125、0.25、0.5 g，分别加入混合对照品溶液（白术内酯Ⅰ0.044 8 mg·mL-1；白术内酯Ⅱ0.028 1 mg·mL-1；白术内酯Ⅲ0.07 38 mg·mL-1）0.5、1.0、2.0 mL；苍术酮对照品（苍术酮1.782 8 mg·g-1）2.5、5.0、10.0 mL，补充甲醇溶液至20 mL，各平行操作3份，进样10 μL测定，计算加样回收率。结果白术内酯Ⅰ低、中、高浓度的回收率（n=3）分别为100.62%、98.14%、98.85%，RSD分别为1.07%、0.40%、1.05%；平均回收率（n=9）为99.20%。白术内酯Ⅱ低、中、高浓度的回收率（n=3）分别为100.19%、97.09%、100.70%，RSD分别为1.40%、0.41%、0.68%；平均回收率（n=9）为99.33%。白术内酯Ⅲ低、中、高浓度的回收率（n=3）分别为101.82%、99.86%、100.40%，RSD分别为1.46%、0.62%、0.47%；平均回收率（n=9）为101.03%。苍术酮低、中、高浓度的回收率（n=3）分别为97.89%、95.64%、99.83%，RSD分别为0.38%、0.17%、0.07%；平均回收率（n=9）为97.79%。
2.1.10 校正因子计算分别精密吸取混合对照品溶液1、2、6、10、15、20 μL，进样，以丹皮酚为内标，计算白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及苍术酮的相对校正因子，见表 3。
|
|
表 3 丹皮酚对白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、苍术酮的相对校正因子 Table 3 Relative correcting factors(RCF)of paeonol to atractylenolideⅠ, atractylenolideⅡ, atractylenolide Ⅲ and atractylone |
精密吸取混合对照品溶液1、2、6、10、15、20 μL进样分析，计算以丹皮酚为内标的白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、苍术酮的相对校正因子。分别采用3种高效液相色谱仪和3种色谱柱考察白术系统耐用性。结果见表 4、5。
|
|
表 4 不同仪器测得相对校正因子（n=2） Table 4 Relative correcting factors determined by different instruments |
|
|
表 5 不同色谱柱测得相对校正因子（n=2） Table 5 Relative correcting factors determined by different columns |
根据校正因子计算结果，得到白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及苍术酮相对于丹皮酚的平均校正因子分别为1.040 0、1.474 0、0.681 6、0.234 8。
取供试品按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，利用平均相对校正因子计算不同白术饮片中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、苍术酮含量，并分别与外标法计算得到的含量进行比较，结果见表 6~9。
|
|
表 6 不同来源白术饮片中4个成分含量测定结果（n=2） Table 6 Determination results of four components in Rhizoma Atractylodis Macrocephalae decoction pieces from different sources |
|
|
表 7 不同来源麸炒白术饮片中4个成分含量测定结果（n=2） Table 7 Determination results of four components in Rhizoma Atractylodis Macrocephalaedecoction pieces (stir-fried with bran) from different sources |
|
|
表 8 不同来源土炒白术饮片中4个成分含量测定结果（n=2） Table 8 Determination results of four components in Rhizoma Atractylodis Macrocephalae decoction pieces (soil-fried) from different sources |
|
|
表 9 不同来源焦白术饮片中4个成分含量测定结果（n=2） Table 9 Determination results of four components in Rhizoma Atractylodis Macrocephalae decoction pieces (deep-fried) from different sources |
本研究对检测波长进行了着重考察，通过3D光谱图发现，进行含量测定的4种化合物中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ在220 nm处有较大吸收，白术内酯Ⅱ在此波长下无吸收，其最大吸收波长为276 nm，苍术酮等挥发油类化合物在200 nm处有较大吸收，且末端吸收下基线较稳定，因此选择切换波长。
3.2 色谱条件的考察本研究考察了甲醇-水及乙腈-水2种流动相系统，结果采用乙腈-水系统，各类成分均得到较好的分离。分别对Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex® Gemini 5μ C18 110A（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Capcell pak C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）等色谱柱进行考察，最终选择Kromasil 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），各色谱峰分离效果最佳。
3.3 内标物质的选择本研究对一测多评内标物质进行了考察，由于白术饮片中主要含挥发油成分，性质较不稳定，且对照品整体价格较高，因此考虑加入内标物质。本研究对内标物质的理化性质、紫外吸收波长、价格等方面进行了综合考察，共考察了丹皮酚、穿心莲内酯、厚朴酚、和厚朴酚4种对照品，结合液相谱图，发现丹皮酚出峰时间与白术饮片各成分均能达到基线分离，对含量测定结果无影响，因此选定丹皮酚为白术饮片一测多评内标物质。
3.4 外标法和一测多评法的比较研究本研究考察不同仪器和色谱柱对校正因子的影响，验证一测多评法在白术质量控制中的可行性和适用性，并且比较了4种白术饮片外标法与一测多评法的含量测定结果。结果表明本实验条件下相对校正因子具有较好的重现性，4种白术饮片一测多评含量测定结果与外标测定结果之间均无显著性差异。本研究提供的相对校正因子可以在缺乏定量用白术对照品的情况下，以丹皮酚对照品作为内标物质，实现白术中多成分的含量测定。
| [1] |
中国药典2015年版. 一部[S]. 2015: 103 ChP 2015. Vol Ⅰ[S]. 2015:103 |
| [2] |
张程荣, 曹岗, 丛晓东, 等. 白术化学成分和质量控制研究进展[J]. 中华中医药杂志, 2011, 26(10): 2328. ZHANG CR, CAO G, CONG XD, et al. Advances in studies on chemistry and quality control of Atractylodes Macrocephala Koidz[J]. China J TCM Pharm, 2011, 26(10): 2328. |
| [3] |
李伟. 白术的有效物质及质量研究[D]. 南京: 南京中医药大学, 2001 LI W. Studies on the Effective Constituents and Quality of Atractylodes Macrocephala[D]. Nanjing:Nanjing University of Chinese Medicine, 2001 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10315-2001013279.htm |
| [4] |
杨娥, 钟艳梅, 冯毅凡, 等. 白术化学成分和药理作用的研究进展[J]. 广东药学院学报, 2012, 28(2): 218. YANG E, ZHONG YM, FENG YF, et al. Advance in the chemical constituents and pharmacological effects of Atractylodes Macrocephala Koidz[J]. J Guangdong Pharm Univ, 2012, 28(2): 218. |
| [5] |
李滢, 陶海燕, 杨秀伟. 生白术和炒白术挥发油成分的GC-MS分析[J]. 药物分析杂志, 2013, 33(7): 1210. LI Y, TAO HY, YANG XW. GC-MS analysis of the essential oil components in Atrac tylodes Macrocephala Rhizoma and its stirbaked products[J]. Chin J Pharm Anal, 2013, 33(7): 1210. |
| [6] |
周枝凤, 沈菊文, 龚范. 白术挥发油成分分析及其色谱指纹图谱研究初探[J]. 中草药, 2004, 35(1): 5. ZHOU ZF, SHEN JW, GONG F. Study on essential oil anditsfingerprint spectrum of Atractylodes Macrocephala[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2004, 35(1): 5. |
| [7] |
李伟, 张爱华. 白术质量标准研究Ⅰ——HPLC法测定2种白术内酯的含量[J]. 药物分析杂志, 2001, 21(3): 170. LI W, ZHANG AH. Study on quality of Atractylodes Macrocephala Koidz Ⅰ-Determination of 2 atractylenolides by HPLC[J]. Chin J Pharm Anal, 2001, 21(3): 170. |
| [8] |
李伟, 文红梅, 崔小兵, 等. HPLC法测定白术中白术内酯Ⅱ的含量[J]. 现代中药研究与实践, 2005, 19(5): 35. LI W, WEN HM, CUI XB, et al. Determination of atractylenolide Ⅱ in Atractylodes Macrocephala by HPLC[J]. Res Pract Chin Med, 2005, 19(5): 35. |
| [9] |
于永明, 宋长义, 贾天柱, 等. 白术炮制品种的质量标准研究[J]. 中成药, 2005, 27(6): 669. YU YM, SONG CY, JIA TZ, et al. Quality standard of processed products of Atractylodes Macrocephala Rhizoma[J]. Chin Tradit Pat Med, 2005, 27(6): 669. |
| [10] |
许详军, 陈敏, 宗璐, 等. 不同品规白术中白术内酯Ⅰ、Ⅲ的含量测定[J]. 中国医院药学杂志, 2011, 31: 1421. XU XJ, CHEN M, ZONG L, et al. Determination of atrectylenolide Ⅰ and Ⅲ in the Atractylodes Macrocephala Rhizoma from different habitats[J]. Chin Hosp Pharm, 2011, 31(17): 1421. |
| [11] |
阎克里, 朱秀卿, 赵丽. HPLC法同时测定白术挥发油中5中抗肿瘤成分含量[J]. 药物分析杂志, 2011, 31(6): 1106. YAN KL, ZHU XQ, ZHAO L. HPLC simultaneous determination of five anti-tumor components in the Atractylodes Macrocephala Rhizoma volatile oil[J]. Chin J Pharm Anal, 2011, 31(6): 1106. |
| [12] |
刘玉强, 才谦. 50批不同来源白术药材及饮片中白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ含量的HPLC法测定[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(7): 1249. LIU YQ, CAI Q. HPLC determination of atrectylenolide Ⅰ and atrectylenolide Ⅲ in 50 batches of crude drugs and slices of Atractylodes Macrocephala Rhizoma from different sources[J]. Chin J Pharm Anal, 2012, 32(7): 1249. |
| [13] |
尹华, 王知青, 王玲, 等. HPLC-DAD波长切换法同时测定白术中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和苍术酮的含量[J]. 中华中医药杂志, 2013, 28(1): 233. YIN H, WANG ZQ, WANG L, et al. HPLC-wavetength switching simultaneous determination of atractylone, atractylenolide Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ in Atractylodes Macrocephala[J]. China J Tradit Chin Med Pharm, 2013, 28(1): 233. |
| [14] |
闫晗, 孙媛媛, 于治国, 等. HPLC法同时测定白术药材中白术内酯Ⅰ等4种有效成分的含量[J]. 沈阳药科大学学报, 2015, 32(9): 699. YAN H, SUN YY, YU ZG, et al. Simultaneous determination of the content of four effective constituents including atractylenolide Ⅰ in Atractylodes Macrocephala by HPLC method[J]. J Shenyang Pharm Univ, 2015, 32(9): 699. |
| [15] |
王智民, 钱忠直, 张啟伟, 等. 一测多评法建立的技术指南[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(6): 657. WANG ZM, QIAN ZZ, ZHANG QW, et al. Technical guide for QAMS[J]. China J Chin Mater Med, 2011, 36(6): 657. |