水蛭蛴螬化瘀片由水蛭、蛴螬、丹参等13种药味组成，具有活血祛瘀、化瘀止痛的功效，用于子宫内膜异位症、腺肌症、陈旧性宫外孕、盆腔炎性包块等气滞血瘀所致的癥瘕积聚及包块，临床疗效显著。本实验在已有的薄层鉴别的基础上增加多种活性成分的含量测定，完善质量标准，提高成品质量的均一性、稳定性。

HPLC法的广泛运用在很大程度上是因为其流动相组成容易改变，可以快速优选出最佳的分离条件。流动相的选择从原来的单组分发展到现在的多组分，主要是在于后者能提高样品分离度，优化色谱峰形和缩短分离时间^[1]。在高效液相色谱中，对于复杂样品体系，多元流动相梯度洗脱结合了多元流动相提供的高选择性和梯度洗脱分析时间短的优势，是一种非常有效的洗脱方式^[2]。此外，单一波长难以同时测量多种活性成分的含量，因此，本实验采用多波长切换三元流动相梯度洗脱的方法。结果证明本研究建立的方法，通过方法学验证，操作简便，重复性好，为水蛭蛴螬化瘀片的质量控制提供依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技公司）；BP-211D电子分析天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器（中国）有限公司）；Insertsustain C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；岛津公司）；LE204E电子分析天平（万分之一，梅特勒托利多仪器公司）；98-1-C型数字控温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；AS20500BD超声清洁仪（功率250 W、频率50 kHz，天津奥特赛恩斯仪器公司）。

1.2 试药

黄芩（批号1408018）、丹参（批号1408033）、生蒲黄（批号1410013）、甘草（批号1409006）、赤芍（批号1409022）、酒白芍（批号1405055）、醋延胡索（批号1408049）等均购自四川新荷花中药饮片股份有限公司，经成都中医药大学附属医院药剂科副主任药师盛蓉鉴定，均符合2015年版中国药典一部的有关规定。

对照品黄芩素（批号111595-201308，纯度97.8%）、汉黄芩素（批号111514-200403，纯度98.4%）、黄芩苷（批号110715-201318，纯度93.3%）、汉黄芩苷（批号112002-201501，纯度98.8%）、丹酚酸B（批号111562-201313，纯度97.0%）、芍药苷（批号110736-201438，纯度96.4%）、丹参素钠（批号110855-201311，纯度98.1%）、延胡素乙素（批号110726-201414，纯度99.9%）、甘草酸铵（批号110731-201317，纯度92.6%）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（批号111571-200604，纯度100%），均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈均为色谱纯，超纯水自制，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适用性

采用Insertsustain C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃，以0.2%醋酸为流动相A，甲醇为流动相B，乙腈为流动相C，梯度洗脱（见表 1），流速1.0 mL·min^-1，检测波长280 nm（0~20 min，33~36 min，38.8~42 min检测丹参素钠、延胡索乙素、黄芩苷）、230 nm（20~29 min，检测芍药苷）、254 nm（29~33 min，检测异鼠李素-3-O-新橙皮苷）、252 nm（62~70 min检测甘草酸铵）、286 nm（36~38.8 min检测丹酚酸B）、274 nm（42~48 min，70~80 min检测汉黄芩苷、汉黄芩素）、276 nm（48~62 min，检测黄芩素），进样量10 μL。

2.2 溶液制备 2.2.1 供试品溶液

精密称定水蛭蛴螬化瘀片粉末0.3 g，置25 mL量瓶中，以80%甲醇溶解，超声（功率250 W，频率50 kHz）处理40 min，冷却至室温，定容，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液，备用。

2.2.2 阴性样品溶液

分别制备缺黄芩、丹参、甘草、蒲黄、桃仁、赤芍和酒白芍、延胡索的阴性样品，按“2.2.1”项下方法操作，即得。

2.2.3 对照品溶液

精密称取上述10个对照品适量，分别制成质量浓度为黄芩素0.473 mg·mL^-1、汉黄芩素0.278 mg·mL^-1、黄芩苷0.467 mg·mL^-1、汉黄芩苷0.198 mg·mL^-1、异鼠李素-3-O-新橙皮苷0.673 mg·mL^-1、甘草酸铵1.033 mg·mL^-1、丹参素钠1.319 mg·mL^-1、延胡索乙素0.350 mg·mL^-1、丹酚酸B 1.336 mg·mL^-1、芍药苷0.963 mg·mL^-1的对照品溶液，置0~4 ℃冰箱中备用。

2.2.4 混合对照品溶液

精密称取“2.2.3”项下黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、甘草酸铵、延胡索乙素的对照品溶液各2 mL及另外3个对照品溶液各3 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系考察和检测限、定量限测定

精密吸取“2.2.4”项下的混合对照品溶液5、2、1、1、1 mL，分别置5、5、5、10、25 mL量瓶中，制备黄芩素、汉黄芩素、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、甘草酸铵、延胡索乙素、丹参素钠对照品溶液的浓度梯度，精密吸取“2.2.3”项下的丹酚酸B对照品溶液5、2、1、1、1 mL，分别置5、5、5、10、25 mL量瓶中，“2.2.3”项下黄芩苷、汉黄芩苷、芍药苷的对照品溶液操作同丹酚酸B，分别制备丹酚酸B、黄芩苷、汉黄芩苷、芍药苷对照品溶液的浓度梯度，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项色谱条件进样。以峰面积积分值Y为纵坐标，对应的对照品质量浓度X（μg·mL^-1）为横坐标，进行回归分析，得回归方程、线性范围及相关系数（r）；将“2.2.3”项下各对照品溶液逐级稀释，色谱峰以信噪比为3:1及10:1时各对照品的质量浓度分别确定为该方法的检测限和定量限。结果见表 2。

2.3.2 专属性考察

按照“2.1”项下的色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL进样分析，记录色谱图（见图 1）。各组分分离度良好，互不干扰，阴性对照在相应位置上未见色谱峰，本方法专属性良好。

2.3.3 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液（丹参素钠、丹酚酸B、黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、甘草酸铵、延胡索乙素、芍药苷质量浓度分别为31.66、32.06、7.56、4.45、7.47、3.17、10.77、16.53、5.60、23.11 μg·mL^-1）10 μL，1 d内重复进样6次，测定峰面积，计算日内精密度，所得上述10个分析物峰面积的RSD为0.22%~0.69%；1 d内进样1次，连续进样3 d，测定各对照品峰面积，计算日间精密度，所得峰面积的RSD为0.45%~1.2%，结果表明精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，室温放置，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定分析物的峰面积。结果丹参素钠、丹酚酸B、黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、甘草酸铵、延胡索乙素、芍药苷峰面积的RSD分别为1.7%、2.1%、0.44%、0.38%、0.32%、0.64%、0.75%、1.2%、0.86%、0.93%，表明供试品溶液在24 h基本稳定。

2.3.5 重复性试验

取同一批水蛭蛴螬化瘀粉末0.3 g，共6份，精密称定，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，测定峰面积，计算含量及RSD。结果丹参素钠、丹酚酸B、黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、甘草酸铵、延胡索乙素、芍药苷的平均含量分别为2.117、15.644、1.567、0.548、16.523、4.417、0.566、3.362、0.197、8.752 mg·g^-1，RSD分别为1.2%、2.0%、0.54%、0.27%、0.35%、0.62%、0.77%、0.98%、0.79%、0.88%，表明该法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

精密称取已知含量（丹参素钠2.117 mg·g^-1、丹酚酸B15.644 mg·g^-1、黄芩素1.567 mg·g^-1、汉黄芩素0.548 mg·g^-1、黄芩苷16.523 mg·g^-1、汉黄芩苷4.417 mg·g^-1、异鼠李素-3-O-新橙皮苷0.566 mg·g^-1、甘草酸铵3.362 mg·g^-1、延胡索乙素0.197 mg·g^-1、芍药苷8.752 mg·g^-1）的水蛭蛴螬化瘀片粉末0.150 0 g，共6份，精密称定，分别置25 mL量瓶中，分别加入黄芩素（0.226 mg·mL^-1）、汉黄芩素（0.079 2 mg·mL^-1）、汉黄芩苷（0.642 mg·mL^-1）、丹参素钠（0.321 mg·mL^-1）、甘草酸铵（0.488 mg·mL^-1）、延胡索乙素（0.030 8 mg·mL^-1）、芍药苷（1.219 mg·mL^-1）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷（0.085 2mg·mL^-1）的对照品溶液各1 mL，黄芩苷（1.242 mg·mL^-1）、丹酚酸B（1.140 mg·mL^-1）的对照品溶液各2 mL，按“2.2.1”项下方法操作，按“2.1”项下色谱条件进样10 μL，计算回收率，结果显示丹参素钠、丹酚酸B、黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、甘草酸铵、延胡索乙素、芍药苷的平均加样回收率（n=6）分别为97.0%、99.1%、99.0%、98.1%、99.2%、100.2%、98.7%、100.4%、100.2%、100.5%，其RSD分别为1.6%、1.4%、1.4%、1.6%、0.98%、1.8%、2.6%、1.7%、3.0%、2.2%。

2.4 样品含量测定

取3批水蛭蛴螬化瘀片样品，分别按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行含量测定，采用外标一点法计算水蛭蛴螬化瘀片中各成分的含量，结果见表 3。

3 讨论 3.1 检测波长的选择

中药成分复杂，在一个波长下难以体现所有成分的特征，故采用波长切换法。查阅文献发现，已有报道采用HPLC法在280 nm同时测定黄芩中的黄酮类化学成分的含量^[3]，刘金欣等^[1]等研究结果显示黄芩中5个黄酮类成分在280 nm处均有良好的紫外吸收强度，丹参水溶性成分丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B的检测波长均在281 nm附近^[4-5]。暴凤伟^[6]采用HPLC波长切换法确定丹参素钠和丹酚酸B的最大吸收波长分别为280、286 nm。中国药典^[7]中异鼠李素-3-O-新橙皮苷、芍药苷的检测波长分别在254 nm和230 nm，本实验通过对200~400 nm波段的特征图谱进行分析，结合色谱峰个数和峰强度综合考察，发现丹参素钠、延胡索乙素在280 nm有最大吸收，汉黄芩苷和汉黄芩素在274 nm，黄芩素、丹酚酸B、甘草酸铵、异鼠李素-3-O-新橙皮苷和芍药苷分别在276、286、252、254、230 nm处吸收峰最大，与所查文献最大吸收波长基本一致。因此本研究采用了上述7个波长进行切换。

3.2 质量控制及有效成分的确定

中药现代化的目的之一是减少中药复方制剂中的非药效因素，注重其活性成分，提高制剂水平和疗效^[8]，因此如何选择质量控制指标尤为重要。通过查阅文献，延胡索辛散温通，既能活血又能行气，气行血活，通则不痛，其镇痛作用以延胡索乙素作用最强^[9]。方中选取了赤芍和酒白芍，两者区别在于白芍总提物对抑制炎性水肿和炎性渗出均有很好的效果，而在抑制血小板聚集方面，赤芍总提物的作用明显优于白芍总提物^[10]，其主要活性成分芍药苷具有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环等作用^[11]。周卫等^[12]的研究表明，蒲黄五灵脂药对对于血府逐瘀汤有增效作用，揭示此药对对活血化瘀效应的贡献有科学依据，从而选取蒲黄的活性成分异鼠李素-3-O-新橙皮苷进行含量测定。研究表明，黄芩中的黄酮类成分均能抑制血栓形成，具有很好的清除氧自由基和抗氧化作用^[13-14]，丹参素钠和丹酚酸B均为丹参中的水溶性成分，具有抑制血小板凝聚、扩张冠状动脉等作用^[15]。

3.3 流动相系统选择

此方法测定的10个成分主要是黄酮类、菲醌类、生物碱类、皂苷类等，等度洗脱很难分离，故采用下列不同流动相梯度洗脱方式：①0.1%磷酸溶液-乙腈等度不同比例及不同梯度洗脱系统；②0.1%磷酸溶液-甲醇-乙腈等度不同比例及不同梯度洗脱系统；③0.2%磷酸溶液-甲醇-乙腈等度不同比例及不同梯度洗脱系统；④0.1%醋酸溶液-甲醇-乙腈等度不同比例及不同梯度洗脱系统；⑤0.2%醋酸溶液-甲醇-乙腈等度不同比例及不同梯度洗脱系统。实验结果表明，0.2%醋酸溶液-甲醇-乙腈三元流动相梯度洗脱对各成分有很好的分离，提供了非常丰富的色谱信息，故确定⑤为流动相。

3.4 三元流动相的优点

在高效液相色谱中，对于复杂多样的样品体系，采用多元流动相梯度洗脱是一种非常有效的洗脱方式，采用三元流动体系具有较多优点，它可以起到修饰峰形，提高分离度，缩短保留时间的作用。而且在第三流动相的选择上有较大的范围，可以针对不同的样品分析选择不同流动相以达到完全分离的目的。

3.5 柱温对分离效果的选择

在其他色谱条件不变的情况下，设定柱温为25、30、35 ℃，结果显示25 ℃分离效果良好，本实验选择柱温25 ℃。

3.6 小结

水蛭蛴螬化瘀片原质量标准中只对丹参、酒大黄进行了薄层鉴别，不能全面反映该制剂的质量。本研究在此基础上，同时对方中各药材10个活性成分进行含量测定，方法简便、准确，重复性好，对水蛭蛴螬化瘀片质量控制和临床用药安全具有积极意义，为更全面评价和控制水蛭蛴螬化瘀片的质量提供了实验依据。