2017, Vol. 37 
2. 资阳市食品药品检验所, 资阳 641300;
3. 首都医科大学中医药学院, 北京 100069
2. Ziyang Institute for Food and Drug Control, Ziyang 641300, China;
3. School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China
重楼是中国药典2015年版一部收录品种，根茎入药，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效[1]，是云南白药、宫血宁和季德胜蛇药等中成药的重要原料。云南重楼（Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.是重楼的基原之一，因使用量不断加大，生长周期较长，野生资源过度采集，现已趋于枯竭，目前市场上以栽培品为主。据文献报道，甾体皂苷是重楼中的主要活性成分，现已从重楼属植物中分离鉴定200多个甾体皂苷类成分，其苷元主要有薯蓣皂苷元、偏诺皂苷元、伪原薯蓣皂苷元。本研究中伪原薯蓣皂苷和伪原纤细薯蓣皂苷属于伪薯蓣皂苷；重楼皂苷Ⅶ、D、H、Ⅵ属于偏诺皂苷；重楼皂苷Ⅱ、Ⅰ、Ⅴ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷属于薯蓣皂苷[2-7]。采用HPLC或UPLC法测定重楼中甾体皂苷类成分有一些报道。目前，中国药典含量测定项下控制重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ共4个成分的总含量不少于0.60%。邹亮等[8]采用HPLC法测定了不同产地云南重楼中的4种重楼皂苷；李懿等[9]采用HPLC法测定了云南重楼的6种皂苷。由于重楼皂苷结构复杂、数量较多、分离困难，采用HPLC法测定分析时间一般需要1~2 h。王永慧等[10]采用UPLC法测定重楼药材中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量；韩燕全等[11]采用UPLC-ELSD法测定4个皂苷成分；张绍山等[12]采用UPLC-ELSD法测定了云南重楼中7种甾体皂苷含量；KANG等[13]采用UPLC/Q-TOF MSE对云南重楼进行了定性研究。本研究建立UPLC法同时测定云南重楼栽培品中伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ共11种甾体皂苷的含量，为云南重楼药材的质量评价提供参考。
1 仪器和材料 1.1 仪器H-Class型超高效液相色谱仪（沃特世公司），二极管阵列检测器（沃特世公司），QUINTIX313-1CN型万分之一电子天平（Sartorius公司），MSE125S型十万分之一电子天平（Sartorius公司），KQ-500DV型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q纯水仪（密理博公司）。色谱柱CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm，Waters公司）。
1.2 试药对照品重楼皂苷Ⅶ（批号111593-201303，供含量测定用），重楼皂苷Ⅱ（批号111591-201103，供含量测定用）、重楼皂苷Ⅵ（批号111592-201303，供含量测定用），重楼皂苷Ⅰ（批号111590-201103，供含量测定用）均由中国食品药品检定研究院提供；对照品伪原薯蓣皂苷（批号：S07M6L1）、伪原纤细薯蓣皂苷（批号：W23J7K16482）、重楼皂苷H（批号：C20J7G16481）由上海源叶生物科技有限公司提供；重楼皂苷D（批号151105）和重楼皂苷Ⅴ（批号150716）由成都菲普德生物技术有限公司提供，薯蓣皂苷（批号：15110210）和纤细薯蓣皂苷（批号：15181110）由北京中科质检生物技术有限公司提供，HPLC-DAD（面积归一化法）检测纯度均大于98.0%。甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher公司），试验用水为超纯水。
1.3 药材药材采自产地，样品经中国食品药品检定研究院民族药室郑健研究员鉴定为百合科云南重楼（Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.的干燥根茎。
2 溶液的制备 2.1 混合对照品溶液的制备取伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ对照品适量，精密称定，分别置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得上述11种成分质量浓度分别为1 003、1 012、986、956、948、886、1 028、1 008、985、868、878 μg·mL-1的对照品储备液。分别取各对照品储备液0.5 mL，置同一个10 mL量瓶中，加甲醇配制成上述11种成分质量浓度分别约50 μg·mL-1的混合溶液，即得。
2.2 供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称量，加热回流30 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
3 色谱条件与系统适用性色谱柱：Waters CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0~18 min，30%A→50%A；18~28 min，50% A），流速0.3 mL·min-1，检测波长为203 nm，柱温30 ℃，进样量1 μL。在上述色谱条件下，理论塔板数均不低于4 000，相邻峰之间分离度均大于1.5。混合对照品及云南重楼药材（样品4）色谱图见图 1。
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1.伪原薯蓣皂苷（pseduoprodioscin）2.伪原纤细薯蓣皂苷（pseudoprotogracillin）3.重楼皂苷Ⅶ（paris saponin Ⅶ）4.重楼皂苷D（paris saponin D）5.重楼皂苷H（paris saponin H）6.重楼皂苷Ⅵ（paris saponin Ⅵ）7.重楼皂苷Ⅱ（paris saponin Ⅱ）8.薯蓣皂苷（dioscin）9.纤细薯蓣皂苷（gracillin）10.重楼皂苷Ⅰ（paris saponin Ⅰ）11.重楼皂苷Ⅴ（paris saponin Ⅴ） 图 1 混合对照品溶液（A）及4号云南重楼提取物（B）的UPLC色谱图 Figure 1 UPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and the extract of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz., sample No. 4(B) |
精密吸取各对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mL，分别置于5个10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得1~5号混标溶液；再取1号混标溶液2 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得6号混标溶液。分别精密吸取上述1~6号混标溶液各1 μL，注入液相色谱仪，测定，以各对照品质量浓度（μg·mL-1）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表 1，表明各化合物在相应线性范围内线性关系良好。
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表 1 各被测成分的标准曲线方程、线性范围和相关系数 Table 1 Regressive equations, correlation coefficients, linear ranges of the investigated components |
精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ峰面积的RSD分别为0.55%、0.62%、0.45%、0.34%、0.52%、0.43%、0.65%、0.55%、0.36%、0.76%、0.42%（n=6），表明仪器精密度良好。
4.3 重复性考察取样品粉末（样品4）6份，分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算含量。结果各份供试品溶液的伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ测定结果的RSD（n=6）分别为1.42%、1.75%、1.87%、1.92%、1.67%、1.36%、1.67%、1.86%、1.45%、1.32%和1.96%，表明重复性良好。
4.4 溶液稳定性试验取同一份供试品溶液（样品4），分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ峰面积的RSD（n=6）分别为1.15%、0.78%、0.81%、1.14%、0.67%、0.97%、0.79%、0.56%、1.25%、0.54%和0.75%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
4.5 加样回收试验取已知含量的4号云南重楼样品粉末6份，每份约0.25 g，置具塞锥形瓶中，精密加入各对照品溶液（伪原薯蓣皂苷221.5 μg·mL-1、伪原纤细薯蓣皂苷191.5 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅶ 265.3μg·mL-1、重楼皂苷D 80.3 μg·mL-1、重楼皂苷H 300.6 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅵ 115.2 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅱ102.8 μg·mL-1、薯蓣皂苷100.8 μg·mL-1、纤细薯蓣皂苷65.6 μg·mL-1、重楼皂苷Ⅰ 552.0 μg·mL-1和重楼皂苷Ⅴ50.2 μg·mL-1）各1 mL，分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。结果伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ平均加样回收率（n=6）分别为98.73%、100.30%、101.90%、99.52%、98.33%、100.25%、98.57%、97.70%、101.63%、100.16%和98.80%，RSD分别为2.09%、2.41%、1.77%、2.74%、1.50%、2.35%、2.06%、1.76%、2.82%、2.05%和1.86%。
4.6 样品含量测定分别取不同产地云南重楼药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“3”项下色谱条件进行测定，用外标法计算样品含量。结果见表 2。
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表 2 样品含量测定结果（mg·g-1，n=2） Table 2 Determination results of samples |
本文采用梯度洗脱法分离云南重楼药材栽培品中的11种主要甾体皂苷成分，28 min内完成分离，伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ分离效果良好，符合含量测定要求。本文通过二极管阵列检测器考察所测物质紫外吸收，11种成分均为末端吸收，故选择203 nm作为检测波长。流动相比较了乙腈-水和乙腈-0.05%磷酸系统，乙腈-水梯度洗脱各色谱峰均实现基线分离，能够达到定量要求。
5.2 提取条件的优化本实验对不同提取方式（加热回流和超声）、提取溶剂（50%、70%甲醇水溶液和甲醇）、提取时间（30、45和60 min）和取样量（0.2、0.5和1.0 g）进行考察，最终确定，称取药材粉末0.5 g，加甲醇25 mL加热回流提取30 min为最佳提取条件。
5.3 含量测定结果分析在进行化学成分含量测定时，伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ11种甾体皂苷类成分在药材中的含量表现出了较大差异，不同批次的药材中11种成分的含量相差较大，说明不同采集地对云南重楼中皂苷类成分含量影响较大，造成差异性的原因可能是产地不同，但其是否具有规律性有待进一步深入研究。
从样品测定结果来看，这11种成分中伪原薯蓣皂苷、伪原纤细薯蓣皂苷2种皂苷含量较低，5个薯蓣皂苷（峰7~11）中重楼皂苷Ⅱ和Ⅰ含量最高，4个偏诺皂苷（峰3~6）中重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷H含量相对较高。中国药典含量测定项下4个指标成分之一重楼皂苷Ⅵ含量较低，因此中国药典将重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ 4种皂苷之和控制重楼质量值得商榷，应将薯蓣皂苷类和偏诺皂苷类分别确定含量指标较为合理。
5.4 小结本研究建立的方法可同时测定云南重楼药材栽培品中11种甾体皂苷类成分，方法简便、快速，可用于云南重楼中甾体皂苷类成分含量测定，为云南重楼药材质量综合评价提供准确、快速的定量分析方法，为重楼药材的质量控制提供依据。
| [1] |
中国药典2015年版. 一部[S]. 2015: 260 ChP 2015. Vol Ⅰ[S]. 2015:260 |
| [2] |
杨远贵, 张霁, 张金渝, 等. 重楼属植物化学成分及药理活性研究进展[J]. 中草药, 2016, 47(18): 3301. YANG YG, ZHANG J, ZHANG JY, et al. Research progress in chemical constituents in plants of Paris L. and their pharmacological effects[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2016, 47(18): 3301. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2016.18.027 |
| [3] |
洪燕, 韩燕全, 刘向国, 等. 重楼的质量控制及药理研究进展[J]. 山西中医学院学报, 2013, 14(6): 66. HONG Y, HAN YQ, LIU XG, et al. Quality control of Paris root and advancement on pharmacological study[J]. J Shanxi Coll Tradit Chin Med, 2013, 14(6): 66. |
| [4] |
徐暾海, 毛晓霞, 徐雅娟, 等. 云南重楼中的新甾体皂苷[J]. 高等学校化学学报, 2007, 28(12): 2303. XU TH, MAO XX, XU YJ, et al. New steroidal saponin from Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis(France)Hand. -Mazz[J]. Chem J Chin Univ, 2007, 28(12): 2303. DOI:10.3321/j.issn:0251-0790.2007.12.016 |
| [5] |
刘海, 张婷, 陈筱清, 等. 云南重楼的甾体皂苷类成分[J]. 中国天然药物, 2006, 4(4): 264. LIU H, ZHANG T, CHEN XQ, et al. Steroidal saponins of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis[J]. Chin J Nat Med, 2006, 4(4): 264. |
| [6] |
王羽, 高文远, 袁理春, 等. 滇重楼的化学成分研究[J]. 中草药, 2007, 38(1): 17. WANG Y, GAO WY, YUAN LC, et al. Chem constituents from rhizome of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2007, 38(1): 17. |
| [7] |
王羽, 张彦军, 高文远, 等. 滇重楼的抗肿瘤活性成分研究[J]. 中国中药杂志, 2007, 32(14): 1425. WANG Y, ZHANG YJ, GAO WY, et al. Anti-tumor constituents from Paris polyphylla var. yunnanensis[J]. Chin J Chin Mater Med, 2007, 32(14): 1425. DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2007.14.013 |
| [8] |
邹亮, 周浓, 张海珠, 等. HPLC测定不同产地云南重楼中的4种重楼皂苷[J]. 华西药学杂志, 2009, 24(5): 521. ZOU L, ZHOU N, ZHANG HZ, et al. Determination of four saponins in Paris polyphylla var. yunnanensis from different habitats by HPLC[J]. West China Pharm Sci, 2009, 24(5): 521. |
| [9] |
李懿, 何佳, 赵庭周, 等. HPLC同时测定不同产地云南重楼中的6种重楼[J]. 中成药, 2012, 34(1): 113. LI Y, HE J, ZHAO TZ, et al. Determination of six saponins in determination of four saponins in Paris polyphylla var. yunnanensis from different habitats by HPLC[J]. Chin Tradit Pat Med, 2012, 34(1): 113. |
| [10] |
王永慧, 杨光一, 叶方, 等. UPLC法测定重楼药材中重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的含量[J]. 中国药师, 2012, 15(11): 1596. WANG YH, YANG GY, YE F, et al. Determination of polyphyllin Ⅰ and polyphyllin Ⅱ in Paris polyphylla by UPLC[J]. China Pharm, 2012, 15(11): 1596. DOI:10.3969/j.issn.1008-049X.2012.11.026 |
| [11] |
韩燕全, 洪燕, 夏伦祝, 等. UPLC-ELSD法同时测定重楼中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ[J]. 中草药, 2012, 43(2): 305. HAN YQ, HONG Y, XIA LZ, et al. Simultaneous determination of paris saponins Ⅰ, Ⅱ, Ⅵ and Ⅶ in Paris Rhizoma by UPLC-ELSD[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2012, 43(2): 305. |
| [12] |
张绍山, 刘璇, 王景富, 等. UPLC法测定云南省不同地区云南重楼及多芽品系中7种甾体皂苷量及其指纹图谱建立[J]. 中草药, 2016, 47(23): 4257. ZHANG SS, LIU X, WANG JF, et al. Determination of seven steroidal saponins in Paridis Rhizoma and polygerm varieties from different regions in Yunnan Province by UPLC and establishment[J]. Chin Tradit herb Drugs, 2016, 47(23): 4257. |
| [13] |
KANG LP, YU K, ZHAO Y, et al. Characterization of steroidal glycosides from the extract of Paris polyphylla var. yunnanensis by UPLC/Q-TOF MSE[J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 62(6): 235. |