2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
拳参为蓼科植物拳参Polygonum bistorta L.的干燥根茎，具有清热解毒、消肿、止血之功效，主治赤痢热泻，肺热咳嗽，痈肿瘰疬，口舌生疮，血热吐衄，痔疮出血，蛇虫咬伤[1]。近年研究表明，拳参具有抗炎[2-3]、镇痛[4]、中枢抑制[5]、心肌保护[6]、免疫增强[7]等作用。商品拳参中，同一批次的拳参饮片除切面呈棕红色或浅棕红色（与各版中国药典一部所述特征一致，以下简称棕红色）外，还常见切面呈淡紫红色至紫红色（以下简称紫红色）饮片，张萍等[8]曾对紫红色与棕红色拳参饮片中绿原酸和没食子酸进行了含量测定；付杰超等[9]采用HPLC法测定拳参不同炮制品中没食子酸和绿原酸含量，黄文平等[10]采用RP-HPLC测定不同产地拳参药材中没食子酸和绿原酸含量，刘瑞等[11]采用反相高效液相色谱法测定拳参药材中没食子酸和绿原酸含量。拳参含绿原酸、没食子酸、鞣质、丁二酸、槲皮素、槲皮素-5-O-β-D-葡萄糖苷、原儿茶酸、丁香苷、儿茶素、芦丁等多种化学成分[12-16]，而2种颜色的拳参饮片中除均含有绿原酸、没食子酸外，所含其他成分是否有差异，目前尚未见相关研究报道。本研究建立了拳参的HPLC-MS指纹图谱，对4个产地10批次紫红色与棕红色拳参饮片共20份样品进行指纹图谱分析，并采用高分辨质谱指认其成分，结合代谢组学的多元统计方法，系统分析比较2种不同颜色拳参饮片中的化学成分。
1 仪器与试药 1.1 仪器岛津公司LCMS-IT-TOF高效液质联用色谱仪；岛津公司LCMSsolution工作站；岛津公司Inertsil ODS-SP C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；Solarbio公司0.22 μm微孔滤膜；Sartorius公司BSA224S-CW微量分析天平（d=0.1 mg）；昆山市超声仪器有限公司KQ5200E型超声仪。
1.2 试药乙腈、甲酸均为色谱级，试验用水为娃哈哈纯净水。
对照品绿原酸（批号327-97-9），成都普菲德生物技术有限公司；没食子酸（批号ZGIQ-973B），中国食品药品检定研究院。
样品拳参饮片产地（见表 1），样品经首都医科大学附属北京友谊医院张萍主任药师鉴定，均为蓼科植物拳参Polygonum bistorta L.的干燥根茎。紫红色和棕红色饮片来自同一批号。
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表 1 2种颜色拳参饮片样品的产地和批号 Table 1 Habitats and lot numbers of Bistortae Rhizoma prepared slides in 2 colors |
采用Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，流动相为1%甲酸水溶液（A）-1%甲酸乙腈（B），洗脱梯度（0~8 min，3%B；8~10 min，3%B→ 6%B；10~ 15 min，6%B→8%B；15~20 min，8%B→10%B；20~ 28 min，10%B→30%B，28~30 min，30%B→50%B；30~45 min，50%B→80%B，45~70 min，80%B→ 100%B），流速0.8 mL·min-1，检测波长290 nm，柱温40 ℃，进样量8 μL。
2.2 质谱条件离子源检测模式：ESI±；离子源电压：4.5 kV+，3.5 kV-；；扫描范围：m/z 100~1 000；加热块温度：200 ℃；雾化器流量：N2，1.5 L·min-1；气体压力：N2，100 kPa；脱溶剂管温度：200 ℃。
2.3 混合对照品溶液的制备取绿原酸及没食子酸的对照品各0.1 mg，精密称定，加20%乙醇制成质量浓度均为0.1 mg·mL-1的绿原酸和没食子酸的混合溶液，即得。
2.4 供试品溶液的制备取拳参样品粉末（过40目筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入20%乙醇50 mL静置，浸泡12 h后，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，用0.22 μm微孔滤膜滤过，收集滤液，即得。
2.5 方法学考察 2.5.1 精密度试验取3号样品制备的供试品溶液，连续进样5次，记录色谱图；以绿原酸为指标求得其峰面积的RSD为1.3%，表明仪器精密度良好。
2.5.2 稳定性试验取5号样品制备的供试品溶液，分别在0、2、4、6、24 h进样，记录色谱图；以绿原酸为指标求得其峰面积的RSD为2.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.5.3 重复性试验取6号样品5份，按“2.4”项下方法制备成供试品溶液，分别进样并记录色谱图。结果显示，各主要成分色谱峰相对保留时间以及单峰面积占总峰面积5%以上峰面积比值均无明显变化，RSD在4.2%以内，表明该方法重复性良好。
3 结果与分析 3.1 指纹图谱取1~20号拳参饮片样品（表 1）按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，采用相似度分析软件对图谱进行分析。共生成15个共有指纹峰。
利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件，通过多点校正的方法，对1~20号拳参饮片样品进行匹配，生成参照峰R（图 1），并计算各样品之间的相似度，各样品之间相似度均大于0.844（表 2）。采用对照品对照的方法分别指认出没食子酸和绿原酸，对应的保留时间为5.86 min和23.92 min（图 2）。
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图 1 1~20号拳参饮片样品指纹图谱 Figure 1 Fingerprints of No.1-20 Bistortae Rhizoma prepared slides |
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表 2 1~20号拳参饮片样品相似度分析结果 Table 2 Similarity of No.1-20 Bistortae Rhizoma prepared slides |
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图 2 没食子酸（1）、绿原酸（2）混合对照品色谱图 Figure 2 Chromatograms of mixed reference substances of gallic acid(1)and chlorogenic acid(2) |
对2种不同颜色的拳参饮片进行主成分分析，使用Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/）网站对色谱图中62个色谱峰面积构成的数据矩阵（62× 20）进行多元统计分析（图 3）。由主成分分析（PCA）散点图可见，紫红色和棕红色拳参饮片分成了2组。由变量权重值结果可知，影响值大于1.0的化学成分共有13种，由质谱可指认出其中4个（见表 3），分别为山柰酚、原儿茶酸、24（E）-亚乙基环木菠萝烷酮-3α-醇、绿原酸[14]，同时对这4种成分进行色谱峰面积比较，从图 4中可以看出，紫红色拳参饮片中4个化学成分含量均大于棕红色饮片，P < 0.05，有统计学意义。模型有效性验证图得到的参数为R2=0.924，Q2=0.512，说明主成分分析模型有效可用。
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A.主成分分析结果图（results of principal component analysis）[红点a组：紫红色拳参饮片（amaranth Bistortae Rhizoma prepared slides）；绿点b组：棕红色拳参饮片（brownish red Bistortae Rhizoma prepared slides）] B.VIP结果图[result of VIP] C.模型有效性验证图（model validation diagram） 图 3 主成分分析结果图 Figure 3 Results of principal component analysis |
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表 3 质谱化学成分鉴定 Table 3 Chemical constituents identification by MS |
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1.紫红色拳参饮片（amaranth Bistortae Rhizoma prepared slides）2.棕红色拳参饮片（brownish red Bistortae Rhizoma prepared slides）A.山柰酚（kaempferol）B.原儿茶酸（protocatechuic acid）C.绿原酸（chlorogenic acid）D.24（E）-亚乙基环木菠萝烷酮-3α-醇[24（E）-ethylidene cycloartane keto-3α-alcohol] 图 4 2种颜色拳参饮片样品中4个成分色谱峰面积比较 Figure 4 Peak area of 4 components in Bistortae Rhizoma prepared slides of 2 colors |
提取溶剂参照文献[11]选取20%乙醇，色谱条件选择时比较了甲醇-0.4%醋酸水溶液及1%甲酸水溶液-1%甲酸乙腈等度、梯度洗脱系统，最终确定流动相为1%甲酸水溶液-1%甲酸乙腈梯度洗脱方法效果最好。
4.2 2种颜色拳参饮片指纹图谱分析及化学成分比较本实验采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004版）对1~20号拳参饮片样品进行了相似度计算，结果显示各样品之间的相似度均大于0.844，表明紫红色与棕红色拳参饮片主要成分的种类相似。使用Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/）网站对色谱图中62个色谱峰面积构成的数据矩阵（62×20）进行多元统计分析，PCA散点图结果显示，紫红色与棕红色饮片分为2组，表明2种颜色拳参饮片主要成分的含量存在差异。
2种颜色拳参饮片具有15个共有指纹峰，其中由对照品指认绿原酸和没食子酸2个成分；而由VIP分析结果可见，影响值大于1.0的化学成分共有13种，表明这13种化合物应是拳参主要成分。13个成分经高分辨质谱指认出4个，分别为山柰酚、24（E）-亚乙基环木菠萝烷酮-3α-醇、原儿茶酸、与绿原酸，而对这4个成分的色谱峰面积进行比较，紫红色拳参饮片的4个成分的含量均显著高于棕红色饮片（P < 0.05），其中紫红色拳参饮片中绿原酸含量高于棕红色饮片与文献[2]结果一致。
4.3 小结综上所述，2种颜色拳参饮片所含化学成分相似，但主要成分含量存在明显差异，紫红色拳参饮片含量高于棕红色饮片。
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