2017, Vol. 37 
2. 辽宁省现代研究工程实验室, 大连 116600;
3. 辽宁省药品检验检测院, 沈阳 110036
2. Liaoning Province Modern Chinese Medicine Research Engineering Laboratory, Dalian 116600, China;
3. Liaoning Insitute for Drug Control, Shenyang 110023, China
山绿茶为冬青科植物海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）的干燥叶，具有清热解毒、消肿止痛、活血通脉之功效，可用于降血压、降血脂、降胆固醇、冠心病、脑血管意外所致的偏瘫，以及咽喉水肿、风热感冒、扁桃体炎、肺热咳嗽、扁桃体炎、痢疾等病症[1]。山绿茶药材是山绿茶降压胶囊唯一原料药。中药是一个复杂体系，成分多，不同产地、采收期、炮制方法等因素的影响，质量控制成为中药现代化进程中需要解决的关键问题，中药色谱图谱是利用现代先进的分析技术来分析药材的整体特性，以更准确鉴定及识别中药本身的真伪和优劣，全面反映中药所含的物质群，确保中药质量的稳定性[2-3]。本文采用全时段双波长融合HPLC图谱定量方法，同时测定山绿茶药材中6个成分的含量，对于较全面评价山绿茶药材质量具有实际意义。
1 实验材料 1.1 仪器安捷伦公司Agilent 1260高效液相色谱仪；安捷伦公司Agilent Poroshell SB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；赛多利斯集团CP225D电子分析天平（十万分之一）；Millipore公司Milli-Q超纯水处理装置；北京亿健品牌营销管理机构YJ-200A高速中药粉碎机；天津恒奥科技发展有限公司HS6150型超声波清洗器。
1.2 试剂与药材乙腈、乙醇、甲酸为色谱纯；沧州宝恩化工有限公司D101大孔吸附树脂；对照品芦丁（批号151023）、异槲皮苷（批号151120）、绿原酸（批号151217）、异绿原酸A（批号151028）、异绿原酸B（批号150327）、异绿原酸C（批号150724）购自于成都普菲德生物技术有限公司，纯度均≥98%。
自采于广西南宁10批不同采收期新鲜山绿茶药材（S1~S10号样品），阴干，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为Ilex hainanensis Merr.。
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表 1 山绿茶药材样品来源 Table 1 Sources of Ilex hainanensis Merr. |
色谱柱：Agilent Poroshell SB-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），填料：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~15 min，8.0%→17.2%B；15~23 min，17.2%→18.2%B；2 3~33 min，18.2%→ 25.0%B；33~40 min，25.0%→36.0%B）；柱温：30 ℃；检测波长：256 nm（芦丁、异槲皮苷）、328 nm（绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C）；进样量：供试品溶液10 μL，对照品溶液3 uL。
2.1.2 混合对照品溶液的制备精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1 mL含芦丁0.075 mg、异槲皮苷0.081 mg、绿原酸0.069 mg、异绿原酸A 0.154 mg、异绿原酸B 0.034 mg、异绿原酸C 0.236 mg的混合对照品溶液，置于冰箱（4 ℃）内备用。
2.1.3 供试品溶液的制备将山绿茶药材粉碎，过60目筛，取粉末10 g，加15倍量50%乙醇加热回流，每次1 h，重复2次，合并提取液，经旋转蒸发除去乙醇，配制成生药浓度为0.1 g·mL-1的上样溶液，树脂经95%乙醇浸泡过夜，湿法上柱后用95%乙醇溶液洗脱，在流出液与水1:5混合不产生浑浊后，用大量去离子水洗至无乙醇味，备用。以药材与D101树脂用量比1:2（1 g药材，2 mL湿树脂），以2 BV·h-1的体积流量上样，上样液用盐酸、氢氧化钠溶液将pH调至3，用7 BV 50%乙醇以2 BV·h-1洗脱，减压蒸干溶剂[4]，取提取物约30 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇10 mL，称量，超声（150 W，40 kHz）处理30 min，放冷，再称量，用50%乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.4 全时段双波长HPLC图谱融合方法通过DAD检测器对山绿茶HPLC色谱图进行紫外全波长（200~400 nm）扫描，根据扫描结果确定融合波长为256、328 nm。分别从Agilent 1260色谱工作站中导出256、328 nm的dif格式数据文件，使用Matlab软件编程，对dif格式数据进行全时段双波长融合，得到同时反映2个波长信息的色谱图和各图谱数据，相关色谱图见图 1。
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1.绿原酸（chlorogenic acid）2.芦丁（rutin）3.异槲皮苷（isoquercitrin）4.异绿原酸B（isochlorogenic acid B）5.异绿原酸A（isochlorogenic acid A）6.异绿原酸C（isochlorogenic acid C） 图 1 在256 nm波长下样品（A）与在328 nm波长下样品（B）的HPLC图谱以及样品（C）与混合对照品（D）的全时段双波长融合HPLC图谱 Figure 1 HPLC chromatograms of representative sample detected at wavelength of 256 nm(A), 328 nm(B), as well as full time two-wavelength fusion profiles of the sample(C)and mixed reference substances(D) |
取S2号样品的供试品溶液连续进样6次，以异槲皮苷（3号峰）为参照峰，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。各共有峰的相对保留时间的RSD在0.01%~0.47%之间，相对峰面积的RSD在0.13%~2.88%之间，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验取S2号样品的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测得各共有峰相对保留时间的RSD在0.01%~0.48%之间，相对峰面积的RSD在0.15%~2.82%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.7 重复性试验按“2.1.3”项下方法制备S2号样品的供试品溶液6份，进样测得各共有峰相对保留时间的RSD在0.01%~0.14%之间，相对峰面积的RSD在0.16%~2.20%之间，说明方法重复性良好。
2.1.8 共有图谱的建立取10批山绿茶药材样品，分别按供试品溶液的制备方法与检测方法进行操作，记录色谱图并进行全时段多波长融合，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），对10批样品色谱图进行分析，设定S2号样品的图谱为参照图谱，选取“时间窗宽度”为0.1 min，采用中位数法计算，选定31个特征峰进行多点校正，自动匹配，生成山绿茶有效成分的共有模式R，见图 2，选择稳定性和重复性好特征明显的色谱峰为共有峰，共标定31个共有峰，3号峰经对照品指认为异槲皮苷的色谱峰，其色谱峰稳定性良好，故选择该峰为参照峰。
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图 2 10个样品共有模式HPLC图谱 Figure 2 The chromatograms of 10 tested samples and their mutual profile |
精密吸取“2.1.2”项下制备的混合对照品溶液1、3、5、7、9、11、13 μL，分别注入高效液相色谱系统，测得各自峰面积，以对照品进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得各对照品的线性回归方程，结果见表 2。表明各化合物在一定范围内呈良好的线性关系。
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表 2 回归方程及线性范围 Table 2 Regression equation and linear range |
吸取混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录256 nm、328 nm色谱图，将这2个波长进行全时段信息融合，记录融合后色谱峰峰面积，计算芦丁、异槲皮苷、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C融合后峰面积RSD分别为0.16%、0.21%、0.15%、0.31%、0.27%，结果表明仪器的精密度良好。
2.2.3 重复性考察取S2号样品6份，按照“2.1.3”项下方法得到供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录256、328 nm色谱图，将这2个波长进行全时段信息融合，记录融合后色谱峰峰面积，计算芦丁、异槲皮苷、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的平均含量分别为18.48、28.06、14.65、45.06、41.67、55.42 mg·g-1，RSD分别为0.76%、0.49%、1.17%、0.84%、0.61%、1.38%，说明方法重复性良好。
2.2.4 稳定性考察取同一批供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、6、10、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，记录256、328 nm色谱图，将这2个波长进行全时段信息融合，记录融合后色谱峰峰面积，计算芦丁、异槲皮苷、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.37%、1.15%、1.07%、0.35%、0.51%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.5 回收率考察精密称取含量已知的山绿茶样品约1.0 g，6份，分别精密加入1.514 mg·mL-1芦丁对照品溶液2 mL，1.671 mg·mL-1异槲皮苷对照品溶液2 mL，0.827 mg·mL-1绿原酸对照品1.5 mL，2.362 mg·mL-1异绿原酸A对照品溶液2 mL，1.983 mg·mL-1异绿原酸B对照品溶液1.5 mL，2.327 mg·mL-1异绿原酸C对照品溶液2.5 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试溶液。以“2.1.1”项下的色谱条件进样测定，计算芦丁、异槲皮苷、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的加样回收率，结果芦丁、异槲皮苷、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的加样回收率分别为99.6%、101.6%、99.8%、98.3%、101.8%和98.5%，RSD分别为1.3%、1.0%、0.48%、1.9%、1.0%和1.2%，结果表明本方法回收率均在95%~105%之间，符合中国药典（2015年版）的规定。
2.2.6 样品的含量测定按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下条件测定，记录256、328 nm色谱图，将这2个波长进行全时段信息融合，记录融合后色谱峰峰面积，采用外标法测定每份样品中6种化学成分的含量，结果见表 3。
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表 3 10批样品测定结果（mg·g-1，n=2） Table 3 Contents of the investigated components in 10 samples |
本试验考察了甲醇-水、乙腈-水系统，结果发现乙腈-水系统分离效果较好，分析时间短，且梯度洗脱过程中基线平稳，因此选择乙腈-水系统；山绿茶提取物中主要为黄酮类、酚酸类成分，因此把流动相调整为弱酸性有利于改善峰形，提高分离度，本试验考察了在水相中添加0.02%、0.05%、0.1%的甲酸溶液，结果发现0.1%的甲酸溶液可以达到改善峰形，提高分离度的效果，且较低浓度的甲酸有利于保护柱子，因此选用0.1%甲酸溶液；此外对柱温、流速、进样量等色谱参数进行优化最终确定色谱条件。
3.2 融合波长的选择通过UV全波长扫描（波长200~400 nm）显示芦丁、异槲皮苷在256 nm处有强吸收，绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C在328 nm波长下有强吸收。选择有较强吸收的波长作为融合波长可以减少杂质峰及相应成分的干扰，使测定结果更为准确，故选择融合波长为256 nm和328 nm。
3.3 中药图谱融合技术的选择中药化学成分复杂，每类成分紫外吸收差异较大，单一波长单一成分很难反映中药的整体质量信息，而全时段多波长融合技术正是将现代分析检测手段和信息处理手段结合起来，有效融合中药材指标成分的谱图信息，对同一样品不同成分多波长同时定性定量分析，可以克服单一波长单一指标检测时信息量不足的缺点，从而较完善地反映中药材的内在质量[5-7]。多波长融合图谱不仅实现了建立中药指纹图谱的信息最大化原则，而且为全面真实准确地揭示中药材的内在提供了一种新方法，具有重要的应用价值[8-10]。
3.4 多成分质量控制的意义中医药的整体作用特点，决定着单一成分难以表达中药或中成药的质量，因此对中药及中成药进行多成分同步质量控制是目前国际上广泛认可的中药质量评价模式。山绿茶化学成分复杂，主要含有黄酮、酚酸等成分[11]，经前期药效试验及文献报道，黄酮、酚酸类成分作为药用植物的主要活性成分，具有广泛的药理功能，黄酮类成分有明显的抗心脑血管疾病，抗癌、抗病毒活性等作用[12-14]。酚酸类成分具有防止冠心病、动脉粥样硬化和中风等抗心脑血管疾病、抗氧化等作用[15-16]。基于全时段双波长融合用于山绿茶中6个成分含量的同时测定，为中药山绿茶质量评价提供了新的方法。
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