2017, Vol. 37 
2. 陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心, 咸阳 712046;
3. 西北大学生命科学学院, 西安 710069;
4. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. Shaanxi University of Chinese Medicine Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resource Industrialization, Xianyang 712046, China;
3. College of Life Science, Northwest University, Xi'an 710069, China;
4. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
桃儿七为小檗科（Berberidaceae）植物桃儿七Sinopodophyllum hexandrum （Royle）Ying的根及根茎[1]；植物桃儿七的干燥果实称为小叶莲，为常用藏药，已被中国药典收载[2-3]。桃儿七药材具有祛风除湿、活血止痛、祛痰止咳及调和诸药等功效[4]，民间用于风湿痹痛、跌打损伤、月经不调、痛经、脘腹疼痛、咳嗽等症的治疗[5]。现代药理学表明，桃儿七具有抗肿瘤、抗病毒、杀虫等多种作用[6-7]，其根和根茎中含有大量具有抗癌活性的木脂素类物质，其中抗癌活性最高的鬼臼毒素（podophyllotoxin）是合成4-[4″（2″，2″，6″，6″四甲基哌啶氮氧自由基）氨基]-4′-去甲表鬼臼毒素（GP7）、依托泊苷（etoposide，VP-16）和替尼泊苷（teniposide，VM-26）等抗癌药物的起始物质[8-9]。目前，对桃儿七药材质量研究主要为对鬼臼毒素、槲皮素和山柰酚的报道[10-11]，本文建立了HPLC-PDA梯度洗脱同时测定桃儿七药材中5个主要木脂素类成分（苦鬼臼毒素葡萄糖二苷、4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、鬼臼毒素、鬼臼毒酮）及3个主要黄酮类成分（山柰酚葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚）的含量测定方法，为完善桃儿七药材的质量评价方法提供依据。
1 仪器和材料沃特世公司Waters e2695型高效液相色谱仪（包括自动进样器，四元泵，柱温箱，2998PDA检测器）；美国热电公司Thermo HyPURITY C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；上海捷呈实验仪器有限公司101-A4型电热鼓风干燥箱；梅特勒托利多公司GB204电子天平；昆山市超声仪器有限责任公司舒美KQ-500DE型超声波清洗仪；北京科伟永兴有限公司KEWE电热恒温水浴锅；上海比朗仪器有限公司DYF-200A型高速万能粉碎机。甲醇、磷酸均为色谱纯，实验水为娃哈哈纯净水。
对照品苦鬼臼毒素葡萄糖二苷、山柰酚葡萄糖苷、4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、鬼臼毒素、鬼臼毒酮、山柰酚均为自制，纯度经高相液相色谱按面积归一化法测定均大于98%，符合定量要求。22批桃儿七药材（见表 1）分别于2015—2016年采集或购买于陕西、甘肃、四川、云南、广西、西藏等省区，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为小檗科植物桃儿七Sinopodophyllumhexandrum（Royle）Ying的根及根茎
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表 1 桃儿七药材样品来源 Table 1 Sources of Sinopodophylli Radix et Rhzoma samples |
精密称取苦鬼臼毒素葡萄糖二苷、山柰酚葡萄糖苷、4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、鬼臼毒素、鬼臼毒酮、山柰酚的对照品适量，置同一量瓶中，用甲醇溶解并定容成质量浓度分别为0.18、0.192、0.648、1.984 5、0.94、5.696、0.28、0.72 mg·mL-1的混合溶液，即得。
2.2 供试品溶液的制备精密称取桃儿七药材粉末（过3号筛）约0.50 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加入80%甲醇30 mL，称量，超声（功率250W，频率60 kHz）45 min，放冷，称量，用甲醇补足减失的量，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3 色谱条件采用Thermo HyPURITY C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇（A）-0.4%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（表 2），流速0.8 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长290 nm，进样量10 μL。对照品和样品色谱图见图 1。
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表 2 梯度洗脱的流动相比例 Table 2 Fluid phase proportion of gradient elution |
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1~8.同表 3（same as Tab. 3） 图 1 对照品（A）及S01号样品（B）的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatogram of reference substances(A)and sample No.S01(B) |
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表 3 线性关系 Table 3 Linearity |
精密吸取混合对照品储备液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的混合对照品溶液。吸取上述混合对照品溶液10 μL，按“2.3”项下色谱条件进行分析。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程和线性范围，见表 3；取混合对照品溶液适量，以甲醇逐级稀释，进样测定，当信噪比S/N为3时测得检测限（LOD），S/N为10时测得定量限（LOQ），结果见表 3。
3.2 稳定性试验取S01号样品的供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定；结果苦鬼臼毒素葡萄糖二苷、山柰酚葡萄糖苷、4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、鬼臼毒素、鬼臼毒酮和山柰酚峰面积的RSD（n=6）分别为1.9%、1.9%、0.36%、0.47%、1.3%、0.69%、1.3%和1.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
3.3 精密度试验取混合对照品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，测定峰面积值；结果苦鬼臼毒素葡萄糖二苷、山柰酚葡萄糖苷、4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、鬼臼毒素、鬼臼毒酮和山柰酚峰面积的RSD（n=6）分别为0.61%、1.6%、1.2%、1.4%、1.7%、1.6%、1.5%和1.4%，表明仪器精密度良好。
3.4 重复性试验取S01号药材样品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.3”项下的色谱条件进样，测得苦鬼臼毒素葡萄糖二苷、山柰酚葡萄糖苷、4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、鬼臼毒素、鬼臼毒酮和山柰酚的平均含量（n=6）分别为0.938、0.933、4.588、13.099、4.419、42.032、1.523和3.882 mg·g-1，RSD分别为1.9%、0.90%、1.1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和1.9%，表明该方法的重复性良好。
3.5 回收率试验精密称取已知含量的S01号样品粉末约0.25 g，共9份，3份为1组，按高、中、低浓度分别精密加入混合对照品溶液适量，按“2.2”项下方法，制成高、中、低3个浓度的溶液；以“2.3”项下的色谱条件进样测定，计算平均回收率。结果（表 4）苦鬼臼毒素葡萄糖二苷、山柰酚葡萄糖苷、4′-去甲鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、鬼臼毒素、鬼臼毒酮和山柰酚的平均回收率（n=9）分别为99.8%、99.5%、98.7%、99.4%、98.9%、98.7%、100.1%、100.1%，说明该方法准确度较高。
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表 4 回收率试验结果 Table 4 Results of recovery test |
分别精密称取不同产地的桃儿七样品约0.5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.3”项下的色谱条件进样10 μL进行测定，按表 3中的回归方程计算样品中各成分的含量，结果见表 5。
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表 5 样品含量测定（mg·g-1，n=3） Table 5 Determination results of samples |
本实验考察了加热回流法[12]、超声提取法[13]2种提取方法对桃儿七药材中有效成分含量测定的影响，结果表明超声提取法比加热回流法提取的样品成分多，色谱图峰面积较大；又考察了不同超声时间（15、30、45、60、75 min）、不同超声频率（40、50、60、70、80 kHz）、不同甲醇浓度（60%、70%、80%、90%、100%）、不同料液比（40、50、60、70、80倍量）对桃儿七药材中有效成分含量测定的影响，结果表明60倍量80%甲醇超声（功率250 W，频率60 kHz）45 min，提取效果最好。
5.2 检测波长的选择文献报道[3, 14-15]桃儿七中主要化学成分的检测波长多采用290 nm和360 nm，本实验对8个物质进行紫外全波长扫描，发现在290 nm波长下测定杂质干扰少，灵敏度高，分离度好，因此选择290 nm作为检测波长。
5.3 流动相的选择考察了乙腈-磷酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液等不同比例的流动相进行梯度洗脱，结果表明采用甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脱的色谱峰，基线平直，保留时间适中，分离度均大于1.5，且峰形对称，无拖尾等现象。
5.4 聚类分析结果运用SPSS 19.0统计分析软件对22批桃儿七样品中8个成分含量进行聚类分析，采用组间联接法，以平方Euclidean距离法作为样品间距离计算方法，见图 2。当判别条件距离为15时，22批桃儿七样品主要分为3大类，S1、S2、S4、S5、S9、S11、S12、S13、S15、S20、S22聚为第一大类，S7、S8、S10、S14、S18、S21聚为第二大类，S3、S6、S16、S17、S19聚为第三大类；表明桃儿七药材有效成分含量成呈明显的地域差异，提示桃儿七的药材品质与其生长环境密切相关。
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图 2 桃儿七药材8个成分含量的聚类分析 Figure 2 System cluster analysis based on the content of eight in 22 batches of Sinopodophylli Radix et Rhzoma samples |
由表 5可以看出，桃儿七中8个成分含量最高的是鬼臼毒素，其他依次是苦鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、4′-去甲鬼臼毒素、山柰酚、鬼臼毒酮、鬼臼毒素葡萄糖二苷、山柰酚葡萄糖苷，其中槲皮素、4′-去甲鬼臼毒素、山柰酚的含量相近，鬼臼毒酮、鬼臼毒素葡萄糖二苷、山柰酚葡萄糖苷的含量也相差不大，22批桃儿七中8个成分的含量整体上符合上述规律，但不少样品中个别成分（指含量相近的成分）的含量并不完全遵循上述规律。从单个化学成分来看，22批样品中的8个成分含量的最大值是最小值的4~9倍；从整体上看，22批样品中的8个成分总含量的最大值是最小值的4倍，这可能是由于不同产地的土壤、降水、气候等因素的影响，使药材中的化学成分的含量发生了变化。因此，选择合适的产地尤为重要，也为临床用药提供了科学依据。
5.6 小结采用本实验建立的方法对不同产地的桃儿七药材中8个化学成分的含量进行了测定。结果表明，22批桃儿七药材中含量最高的是鬼臼毒素，含量最低的是山柰酚葡萄糖苷，鬼臼毒素为桃儿七中主要的化学成分。本文建立的HPLC含量测定法，具有灵敏度高，准确性好，重复性好等特点，适用于桃儿七中化学成分的含量测定。
| [1] |
叶耀辉, 马越兴, 张恩慧, 等. 藏药桃儿七与小叶莲HPLC分析及其毒性差异研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2014, 20(18): 80. YE YH, MA YX, ZHANG EH, et al. Study on toxic medicine Radix Podophylli and Fructus Podophylli by HPLC fingerprint and compare their toxicity[J]. Chin J ExpTradit Med Form, 2014, 20(18): 80. |
| [2] |
熊文勇, 魏朔南, 岳明. 桃儿七HPLC指纹图谱研究[J]. 中成药, 2010, 32(11): 1850. XIONG WY, WEI SN, YUE M. HPLC fingerprint of Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying[J]. Chin Tradit Pat Med, 2010, 32(11): 1850. DOI:10.3969/j.issn.1001-1528.2010.11.002 |
| [3] |
邹妍琳, 王佩龙, 刘爽, 等. 桃儿七根茎HPLC指纹图谱研究[J]. 药物分析杂志, 2014, 34(5): 912. ZOU YL, WANG PL, LIU S, et al. Study on HPLC fingerprint of the rhizome of Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying[J]. Chin J Pharm Anal, 2014, 34(5): 912. |
| [4] |
宋小妹, 刘海静. 太白七药研究与应用[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2011, 239. SONG XM, LIU HJ. Research and Application of Taibai Qi Yao[M]. People′s Health Publishing House, 2011, 239. |
| [5] |
袁菊丽. 太白七药桃儿七研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报, 2011, 13(5): 95. YUAN JL. Research progress in Sinopodophyllum emodi Wall[J]. J Liaoning Univ TCM, 2011, 13(5): 95. |
| [6] |
孙彦君, 李占林, 陈虹, 等. 鬼臼类植物化学成分和生物活性研究进展[J]. 中草药, 2012, 43(8): 1626. SUN YJ, LI ZL, CHEN H, et al. Advances in studies on chemical constituents of Podophyllum taxa and their bioactivities[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2012, 43(8): 1626. |
| [7] |
王永慧, 叶方, 杨光义, 等. 鬼臼亚科化学成分和药理作用研究进展[J]. 儿科药学杂志, 2012, 18(12): 59. WANG YH, YE F, YANG GY, et al. The progress in chemical composition and the pharmacological effects research of Podophyllum subfamily[J]. J Pediatr Pharmacy, 2012, 18(12): 59. DOI:10.3969/j.issn.1672-108X.2012.12.022 |
| [8] |
肖培根. 新编中药志[M]. 北京: 化学工业出版社, 2002. XIAO PG. Newly Compiled Record of Chinese Materia Medica[M]. 2nd ed. Beijing: Chemical Industry Press, 2002. |
| [9] |
刘海军, 徐艳, 苏国庆, 等. 桃儿七的研究进展[J]. 中草药, 2004, 35(1): 98. LIU HJ, XU Y, SU GQ, et al. Research progress in Sinopodophyllum emodi[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2004, 35(1): 98. |
| [10] |
李敏, 钟国跃, 伍奥林, 等. 桃儿七中鬼臼毒素、总木脂素的含量与生态因子的相关性研究[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(9): 1831. LI M, ZHONG GY, WU AL, et al. Correlation research on contents of podophyllotoxin and total lignans in Sinopodophyllum hexandrum and ecological factors[J]. China J Chin Mater Med, 2015, 40(9): 1831. |
| [11] |
罗兴平, 杨玲霞, 陈明晶, 等. 高效液相色谱法测定桃儿七中槲皮素及山柰酚[J]. 中成药, 2015, 37(4): 818. LUO XP, YANG LX, CHEN MJ, et al. Quantitative determination of quercetin and kaempferol from Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying by HPLC[J]. Chin Tradit Pat Med, 2015, 37(4): 818. |
| [12] |
王萍, 陈涛, 刘永玲, 等. 响应面法优化桃儿七中鬼臼毒素的热回流提取工艺[J]. 中药材, 2012, 35(11): 1864. WANG P, CHEN T, LIU YL, et al. Optimization of hot reflux extraction technology of podophyllotoxin from Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying[J]. J Chin Med Mater, 2012, 35(11): 1864. |
| [13] |
杨磊, 唐晓溪, 赵春建, 等. 响应面法优选桃儿七中的鬼臼毒素的超声提取工艺[J]. 化工进展, 2009, 28(2): 297. YANG L, TANG XX, ZHAO CJ, et al. Optimization of ultrasonic extraction technology of podophyllotoxin from Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying[J]. Chem Ind Eng Prog, 2009, 28(2): 297. |
| [14] |
李艳玲, 徐文华, 周国英, 等. HPLC法测定青海栽培与野生桃儿七中2种木脂素类的含量[J]. 天然产物研究与开发, 2015, 27(1): 94. LI YL, XU WH, ZHOU GY, et al. Determination of two lignans in Qinghai cultivated and wild Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying by HPLC[J]. Nat Prod Res Dev, 2015, 27(1): 94. |
| [15] |
罗兴平, 杨玲霞, 陈明晶, 等. 高效液相色谱法测定桃儿七中槲皮素及山柰酚[J]. 中成药, 2015, 37(4): 818. LUO XP, YANG LX, CHEN MJ, et al. Quantitative determination of quercetin and kaempferol from Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying by HPLC[J]. Chin Tradit Pat Med, 2015, 37(4): 818. |