2017, Vol. 37 
2. 中国药科大学药学院, 南京 210009;
3. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;
3. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
酮咯酸氨丁三醇((±)-5-苯甲酰-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸，2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，ketorolac tromethamine，简称为KT，结构式见图 1)是可供注射的非甾体抗炎药，1990年上市[1]。酮咯酸氨丁三醇注射液主要适用于需要阿片水平镇痛药的急性较严重疼痛的短期治疗，通常用于手术后镇痛。酮咯酸为一种非选择性环氧合酶(COX)抑制剂[2]，其虽然不直接作用于阿片类受体，但能对阿片类受体起调节作用[3]。酮咯酸的镇痛活性较强，是吗啡的0.4倍，是阿司匹林的800倍、吲哚美辛的60倍[4]。与阿片类镇痛剂相比，酮咯酸具有起效快、无成瘾性、无呼吸抑制作用、作用持续时间长的优点[4]。酮咯酸(游离酸)微溶于水，为了改善其水溶性，满足注射与口服给药的要求，使酮咯酸在体液及胃肠道内快速起效，通常将其制成氨丁三醇盐的形式上市[6-8]。现已上市的酮咯酸氨丁三醇为外消旋体，有研究表明，S-构型酮咯酸盐的镇痛药效比R-构型强230倍，抗炎药效强60倍[9]。
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图 1 酮咯酸氨丁三醇化学结构式 Figure 1 Chemical structure of ketorolac tromethamine |
酮咯酸氨丁三醇质量标准在中国国家药品标准)[10-13]、美国药典(USP 38)[14]4010、英国药典(BP 2015)[15]与欧洲药典(EP 8.0)[16]中均有收录；酮咯酸氨丁三醇注射液质量标准在中国国家药品标准[17-18]与USP 38中有收录[14]4011。USP 38和BP 2015(同EP 8.0)对酮咯酸氨丁三醇中4种杂质[(1RS)-5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-醇、5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-酮、(1RS)-6-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸和(1RS)-5-苯甲酰基-1-甲氧基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸]的限度做出了具体规定，此外USP和BP还给出了(1RS)-5-苯甲酰-N-(1，3-二羟基-2-(羟甲基)-丙烷-2-基)-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-甲酰胺、(1RS)-5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-醇、5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-酮、5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪、(1RS)-6-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸、(1RS)-5-苯甲酰基-1-甲氧基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸、(1RS)-5-苯甲酰基-1-羟基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸甲酯、(1RS)-5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸甲酯、(1RS)-5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸乙酯和(1RS)-7-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸共10种可能杂质的结构(杂质结构见图 2)。
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A. USP杂质A/BP杂质E/(1RS)-5-苯甲酰-N-(1，3-二羟基-2-(羟甲基)-丙烷-2-基)-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-甲酰胺[USP impurity A/BP impurity E/(1RS)-5-benzoyl-N-(1，3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine-1-carboxamide]B. USP杂质B/BP杂质A/(1RS)-5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-醇[USP impurity B/BP impurity A/(1RS)-5-benzoyl-2，3-dihydro-1H-pyrrolizin-1-ol]C. USP杂质C/BP杂质B/5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-酮(USP impurity C/BP impurity B/5-benzoyl-2，3-dihydro-1H-pyrrolizin-1-one)D. USP杂质D/BP杂质I/5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪(USP impurity D/BP impurity I/5-benzoyl-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine)E. BP杂质C/(1RS)-6-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸[BP impurity C/(1RS)-6-benzoyl-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine-1-carboxylic acid]F. BP杂质D/(1RS)-5-苯甲酰基-1-甲氧基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸[BP impurity D/(1RS)-5-benzoyL-1-methoxy-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine-1-carboxylic acid]G. G.BP杂质G/(1RS)-5-苯甲酰基-1-羟基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸甲酯(BP impurity G/ methyl(1RS)-5-benzoyL-1-hydroxy-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine-1-carboxylate)H. BP杂质H/(1RS)-5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸甲酯(BP impurity H/methyl(1RS)-5-benzoyl-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine-1-carboxylate)I. BP杂质J(1RS)-5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸乙酯(BP impurity J/ethyl(1RS)-5-benzoyl-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine-1-carboxylate)J. BP杂质F/(1RS)-7-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-羧酸(BP impurity F/(1RS)-7-benzoyl-2，3-dihydro-1H-pyrrolizine-1-carboxylic acid) 图 2 已知杂质化学结构式 Figure 2 Chemical structures of known impurities |
本研究收集了国内正常生产企业的酮咯酸氨丁三醇及其注射液产品，采用液质联用法对这些产品的有关物质进行了分离和鉴定，共分离出22个有关物质，推断出其中8个主要降解产物的结构，其中5个降解产物为BP或USP收录，1个为文献[19]报道过但未被各国药典收录，2个为新发现的。在研究过程中还将采用液质联用法对有关物质的检测结果与采用现行标准方法得到的检测结果进行了对比。这些研究结果为此品种的药品标准提高工作提供了参考依据。详细的试验过程及实验结果如下。
1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦公司Agilent 1290 Bruker ESI-Q-TOF(Maxis Impact飞行时间质谱液质联用仪)及其附件；戴安公司Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪及其附件；菲罗门公司Extend-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，3 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)；赛多利斯公司CPA224S电子天平(d=0.1 mg)；梅特勒-托利多公司SevenMulti pH计；密理博公司Milli-Q超纯水仪；上海森信实验仪器有限公司电热恒温水浴锅；Salvis Lab真空恒温干燥箱。
1.2 药品与试剂酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406、506150407、506150408；浙江车头制药股份有限公司，批号156781001、156781002、156781003、156781017)；酮咯酸氨丁三醇注射液(山东新时代药业有限公司，批号035150201、035150202、035150203；永信药品工业(昆山)有限公司，批号18E016、18E017、18E018；四川美大康佳乐药业有限公司，批号15120171、15120172、15120771)；乙腈为HPLC Grade，甲酸为Reagent Grade(≥95%)，乙酸铵、盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢铵、磷酸、二氯甲烷为分析纯，四氢呋喃(TEDIA)为色谱纯，30%过氧化氢为优级纯，实验室自制超纯水。
2 实验条件 2.1 液质联用条件 2.1.1 色谱条件采用菲罗门Extend-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，3 μm)，柱温30 ℃，流动相为0.05 mol·L-1乙酸铵溶液(甲酸调节pH至2.5)-乙腈(60:40)，流速0.25 mL·min-1，采用二极管阵列检测器，检测波长313 nm，酮咯酸氨丁三醇及注射液的供试品溶液与对照溶液进样量1 μL，系统适用性溶液与破坏供试品溶液进样量5 μL。
2.1.2 质谱条件采用电喷雾离子源(ESI)，四极杆-时间飞行质量分析器(Q-TOF)，End plate offset为-500 V，毛细管电压4 000 V，雾化器压力0.15 MPa，干燥气流速6.0 L·min-1，干燥气温度180 ℃，正离子扫描，一级扫描和自动二级全扫描，质量扫描范围m/z 50~1 500。
2.2 现行标准有关物质及含量检查色谱条件现行标准中用作酮咯酸氨丁三醇及注射液的有关物质与含量测定的色谱系统总共有3个[10-18]，其中用于有关物质检查的2个色谱系统[10-18]除了所使用色谱柱不同(C8和C18)外，其余色谱条件均相同。有关物质检查所采用的色谱柱为①Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、②Merck Purospher STAR RP-8e C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温40 ℃，流动相为0.05 mol·L-1磷酸二氢铵(磷酸调pH至3.0)-四氢呋喃(70:30)(记为流动相①)，流速1.0 mL·min-1，紫外检测波长313 nm，进样量10 μL。
现行标准中注射液含量测定所采用的色谱柱为Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流动相为甲醇-水-冰醋酸(55:44:1)(记为流动相②)，流速1.0 mL·min-1，紫外检测波长254 nm，进样量10 μL。
2.3 样品处理方法 2.3.1 系统适用性溶液(USP 38)制备称取酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)30 mg于250 mL分液漏斗中，加水100 mL，二氯甲烷100 mL和1 mol·L-1盐酸溶液1 mL，摇匀，静置分层，取下层置于碘瓶中，取1 mL置无色透明液相小瓶中，置日光下直射15 min后，放在通风处挥干后，用水-四氢呋喃(70:30)1 mL溶解，即得。
2.3.2 液质系统中样品处理方法 2.3.2.1 常温放置7 d系统适用性溶液将制备系统适用性溶液时所用的碘瓶中溶液室温放置7 d，取1 mL置液相小瓶中，放在通风处挥干后，用水-四氢呋喃(70:30)1 mL溶解，作为常温放置7 d系统适用性溶液。
2.3.2.2 液质系统中酮咯酸氨丁三醇原料药、制剂样品及其自身对照溶液制备精密称取酮咯酸氨丁三醇300 mg于10 mL量瓶中，以水-乙腈(60:40)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为原料药供试品溶液。
取注射液直接作为注射剂供试品溶液。
精密量取原料药或注射剂供试品溶液1 mL，置200 mL量瓶中，用水-乙腈(60:40)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
2.3.2.3 高温破坏供试溶液制备精密称取酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)20 mg于碘瓶中，加水-乙腈(60:40)50 mL溶解，水浴2 h，放冷，即得。
2.3.2.4 碱破坏供试溶液制备精密称取酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)20 mg于碘瓶中，加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液50 mL溶解，放置4 h后用0.1 mol·L-1盐酸溶液调节pH至中性，即得。
2.3.2.5 酸破坏供试溶液制备精密称取酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)20 mg于碘瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液50 mL，摇匀，放置4 h后用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH至中性，即得。
2.3.2.6 氧化破坏供试溶液制备精密称取酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)20 mg于碘瓶中，加0.3%过氧化氢溶液50 mL溶解，放置4 h，即得。
2.3.2.7 光破坏供试溶液制备精密称取酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)20 mg于碘瓶中，加水-乙腈(60:40)50 mL溶解，置于日光下照射6 h，即得。
2.3.3 现行标准有关物质检查中样品处理方法 2.3.3.1 流动相①条件下酮咯酸氨丁三醇原料药、制剂样品及其自身对照溶液制备精密称取酮咯酸氨丁三醇20 mg于50 mL量瓶中，用水-四氢呋喃(70:30)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为原料药供试品溶液。
精密量取酮咯酸氨丁三醇注射液1 mL于10 mL量瓶中，用水-四氢呋喃(70:30)稀释至刻度，摇匀；精密量取2 mL置15 mL量瓶中，用水-四氢呋喃(70:30)稀释至刻度，摇匀，作为注射液供试品溶液。
精密量取原料药或注射剂供试品溶液1 mL至200 mL量瓶中，用水-四氢呋喃(70:30)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
2.3.3.2 流动相②条件下酮咯酸氨丁三醇原料药、制剂样品及其自身对照溶液制备精密称取酮咯酸氨丁三醇20 mg于50 mL量瓶中，用甲醇-水(55:44)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为原料药供试品溶液。
精密量取酮咯酸氨丁三醇注射液1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇-水(55:44)稀释至刻度，摇匀；精密量取2 mL置15 mL量瓶中，用甲醇-水(55:44)稀释至刻度，摇匀，作为注射液供试品溶液。
精密量取原料药或注射剂供试品溶液1 mL至200 mL量瓶中，用甲醇-水(55:44)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
3 实验结果 3.1 有关物质检查图谱与结果按“2.1”项下的色谱条件与质谱条件，对“2.3.1”和“2.3.2”项下的溶液进行HPLC分离与DAD、MS以及MS/MS的检测，获得酮咯酸氨丁三醇系统适用性溶液、强制降解供试溶液、酮咯酸氨丁三醇原料药及注射液样品液质系统有关物质检查的液相色谱图和全扫描总离子流质谱图。典型色谱图及总离子流图见图 3~4。
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A.系统适用性溶液(USP 38)[system suitability solution(USP 38)] B.酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot.506150406)]C.酮咯酸氨丁三醇注射液(山东新时代药业有限公司，批号035150201)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot.035150201)] 色谱条件：菲罗门Extend-C18柱(100 mm×4.6 mm，3 μm)；柱温30 ℃；流动相：0.05 mol·L-1乙酸铵溶液(甲酸调节pH至2.5)-乙腈(60:40)；流速0.25 mL·min-1；二极管阵列检测器，检测波长313 nm[chromatography conditions：Phenomenex Extend-C18 column(100 mm×4.6 mm，3 μm)；column temperature：30 ℃；mobile phase：0.05 mol·L-1 ammonium acetate solution(adjust with formic acid to pH 2.5)and acetonitrile(60:40)；flow rate：0.25 mL·min-1；detector：DAD 313 nm] 图 3 系统适用性溶液及供试品溶液的液质系统色谱图 Figure 3 HPLC-DAD-MS chromatograms of system suitability solution and test solution |
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A.系统适用性溶液(USP 38)[system suitability solution(USP 38)]B.酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot.506150406)]C.酮咯酸氨丁三醇注射液(山东新时代药业有限公司，批号035150201)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot.035150201)] 图 4 系统适用性溶液及供试品溶液的总离子流图 Figure 4 TIC profiles of system suitability solution and test solution |
在各种强制降解条件下得到的供试溶液以及原料药与注射剂供试品溶液中总共检测到22种有关物质，根据HPLC-DAD测得各有关物质保留时间从小到大予以编号。
这22种有关物质中，原料药中存在12个，采用自身对照法计算有关物质的含量，含量大于0.05%的有2个；注射液中存在13个，含量大于0.05%的有2个。
对比原料药与注射液样品的有关物质峰的个数，有关物质1、2、4、5、6、15、17、18、20峰为原料药与注射液共有峰，而有关物质21峰原料药中不存在，只有在注射液中才被检出，因为有关物质21峰也存在于新鲜配制与放置了7 d的系统适用性溶液中，而系统适用性溶液是在破坏条件下得到的，所以有关物质21峰应为注射液生产过程中产生的降解产物。
对比原料药与注射液样品中共有的有关物质峰的含量变化，有关物质2、6、15峰的含量有显著上升，这些有关物质应为降解产物，是生产过程与贮存期间需要重点监测的对象。有些有关物质色谱峰，紫外检测器可以检测得到，而质谱检测器未检测到，例如有关物质2、3、8、9、11、21峰。实验结果未发现质谱检测器可以检测得到而紫外检测器未能检测得到的色谱峰。
强制降解实验中常温放置7 d后的系统适用性溶液和USP系统适用性溶液略有重复，但常温放置7 d后溶液所含有的杂质更多，包括别的降解情况下均未产生的杂质(有关物质17)。
3.2 主要有关物质结构的推测表 1列出了质谱检测到的酮咯酸氨丁三醇原料药、酮咯酸氨丁三醇注射液以及酮咯酸氨丁三醇经酸、碱、氧化、高温、光破坏得到的各种有关物质的数据(未列出质谱数据的峰因为其在质谱中未检出)。根据测得的各有关物质母离子的准确质量和二级质谱，综合解析，并参照BP 2015和USP 38给出的酮咯酸氨丁三醇有关物质的结构，结合合成工艺进行综合分析，推断出8个主要降解产物的结构。其中5个为BP或USP中收录的，1个为文献[19]报道过但未被各国药典收录的，2个为新发现的。对酮咯酸氨丁三醇有关物质的质谱解析如下。
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表 1 酮咯酸氨丁三醇及其注射液有关物质信息列表 Table 1 Information of the related substances in ketorolac tromethamine and ketorolac tromethamine injection |
保留时间为15 min，在ESI正离子化模式下，酮咯酸氨丁三醇裂解为酮咯酸，测得酮咯酸的[M+H]+的m/z为256.096 3，与离子组成C15H14NO3+相应，误差为2.0×10-6。酮咯酸[M+H]+的MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为77.038 7、105.033 1、178.049 5、210.090 9。m/z 210为酮咯酸[M+H]+离子发生α-裂解脱去羧基形成的[M+H-CH2O2]+特征碎片离子，m/z 178为酮咯酸[M+H]+离子酮基发生α-裂解脱去苯环形成的[M+H-C6H6]+特征碎片离子，m/z 105为酮咯酸[M+H]+离子或[M+H-CH2O2]+特征碎片离子酮基发生α-裂解脱去杂环部分形成的[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，其进一步脱去CO即得到m/z 77的[M+H-C9H9NO3]+碎片离子，推测其裂解途径如图 5。酮咯酸的二级质谱分析对于解析确认其有关物质具有参考意义。
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图 5 酮咯酸可能的裂解途径 Figure 5 Fragmentation pathway of ketorolac |
相对保留时间为0.31，[M+H]+峰的m/z为331.165 7，离子组成为C18H23N2O4+，误差为-1.3×10-6，其MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为105.033 9、121.075 1、210.093 5、227.117 8。m/z 105为酮咯酸[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，m/z 210为酮咯酸[M+H-CH2O2]+特征碎片离子，推测其含有酮咯酸脱去羧基后的结构单元。根据其推荐离子组成可知其结构内含有2个N，m/z 227比m/z 210多17，推测其比酮咯酸[M+H-CH2O2]+多一NH3结构，结合有关物质4结构与相对分子质量，可以发现其相对分子质量比有关物质4少28，推测其结构比有关物质4少一羰基，所以推测有关物质1结构及其可能裂解途径如图 6、7。
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图 6 有关物质1的推测分子结构 Figure 6 Proposed chemical structure of related substance 1 |
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图 7 有关物质1可能的裂解途径 Figure 7 Fragmentation pathway of related substance 1 |
相对保留时间为0.47，[M+H]+峰的m/z为359.160 0，其相对分子质量358相比酮咯酸氨丁三醇相对分子质量376少了18，其离子组成为C19H23N2O5+，误差为0.5×10-6，其MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为105.033 3、210.090 6。m/z 210为酮咯酸[M+H-CH2O2]+特征碎片离子，m/z 105为酮咯酸[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，推测其含有酮咯酸脱去羧基后的结构单元，根据其相对分子质量以及USP 38推测其结构为酮咯酸的羧基部分与氨丁三醇的氨基部分反应脱去一分子H2O后生成的含酰胺键的化合物，即USP杂质A、BP杂质E。推测其结构及裂解途径如图 8、9。
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图 8 有关物质4的推测分子结构 Figure 8 Proposed chemical structure of related substance 4 |
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图 9 有关物质4可能的裂解途径 Figure 9 Fragmentation pathway of related substance 4 |
相对保留时间为0.56，[M+H]+峰的m/z为272.091 5，比酮咯酸[M+H]+多16，其离子组成为C15H14NO4+，误差为1.0×10-6，其MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为77.039 1、105.033 5。m/z 77为酮咯酸[M+H-C9H9NO3]+碎片离子，m/z 105为酮咯酸[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，推测其含有苯环上连接羰基的结构单元，根据相对分子质量推测其比酮咯酸结构多接了1个羟基，根据BP 2015中的杂质D推测羟基连在酮咯酸羧基的α-C上，其结构和可能裂解途径如图 10、11。
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图 10 有关物质6的推测分子结构 Figure 10 Proposed chemical structure of related substance 6 |
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图 11 有关物质6可能的裂解途径 Figure 11 Fragmentation pathway of related substance 6 |
相对保留时间为0.81，[M+H]+峰的m/z为228.102 0，比酮咯酸[M+H]+少28，其离子组成为C14H14NO2+，误差为-0.4×10-6，MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为77.039 8、105.034 4、122.024 1、150.055 9。m/z 77为酮咯酸[M+H-C9H9NO3]+碎片离子，m/z 105为酮咯酸[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，推测其含有苯环上连接羰基的结构单元，m/z 150的碎片离子比酮咯酸[M+H-C6H6]+特征碎片离子少28，推测有关物质10杂环部分比酮咯酸少了1个CO结构，推测酮咯酸中的羧基变为羟基，参考BP 2015与USP 38，推测有关物质10为(1RS)-5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-醇(即USP杂质B、BP杂质A)，推测其结构及裂解途径如图 12、13。
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图 12 有关物质10的推测分子结构 Figure 12 Proposed chemical structure of related substance 10 |
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图 13 有关物质10可能的裂解途径 Figure 13 Fragmentation pathway of related substance 10 |
相对保留时间为1.18，[M+H]+峰的m/z为244.097 5，比酮咯酸[M+H]+少12，其离子组成为C14H14NO3+，误差为-2.7×10-6，MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为105.034 6、184.072 4、198.092 4、210.092 3、226.084 8。m/z 105为酮咯酸[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，推测其含有苯环上连接羰基的结构单元，根据其相对分子质量，且其在氧化破坏中产生较多，参考文献[19]推测其结构及可能裂解途径如图 14、15。
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图 14 有关物质13的推测分子结构 Figure 14 Proposed chemical structure of related substance 13 |
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图 15 有关物质13可能的裂解途径 Figure 15 Fragmentation pathway of related substance 13 |
相对保留时间为1.35，[M+H]+峰的m/z为226.086 2，比酮咯酸[M+H]+少30，比有关物质10的[M+H]+少2，其离子组成为C14H12NO2+，误差为0.1×10-6，MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为77.039 5、105.034 2、120.009 2、138.018 5、148.040 2。m/z 77为酮咯酸[M+H-C9H9NO3]+碎片离子，m/z 105为酮咯酸[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，推测其含有苯环上连接羰基的结构单元，m/z 148和120碎片离子分别比有关物质10二级质谱中的m/z 150和122特征碎片离子少2，推测其杂环部分结构相比于有关物质10缺少了2个氢，参考BP 2015和USP 38，推测其结构为有关物质10中羟基与邻位碳上的氢发生氧化脱氢，即生成的5-苯甲酰基-2，3-二氢-1H-吡咯嗪-1-酮(即USP杂质C、BP杂质B，见图 16)，推测其可能裂解途径如图 17。
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图 16 有关物质15的推测分子结构 Figure 16 Proposed chemical structure of related substance 15 |
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图 17 有关物质15可能的裂解途径 Figure 17 Fragmentation pathway of related substance 15 |
相对保留时间为3.06，[M+H]+峰的m/z为212.107 0，比酮咯酸[M+H]+少44，其离子组成为C14H14NO+，误差为-0.1×10-6，MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为77.039 3、105.034 0、106.037 5、134.060 1。m/z 77为酮咯酸[M+H-C9H9NO3]+碎片离子，m/z 105为酮咯酸[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，推测其含有苯环上连接羰基的结构单元，m/z 134比酮咯酸[M+H-C6H6]+特征碎片离子少44，推测其结构比酮咯酸少去1个羧基，参考USP 38，推测其结构如图 18(即USP杂质D、BP杂质I)，推测其可能的裂解途径如图 19。
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图 18 有关物质21的推测分子结构 Figure 18 Proposed chemical structure of related substance 21 |
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图 19 有关物质21可能的裂解途径 Figure 19 Fragmentation pathway of related substance 21 |
相对保留时间为4.10，[M+H]+峰的m/z为284.127 4，比酮咯酸[M+H]+大28，推测其结构中比酮咯酸多一CO或者C2H4结构，其离子组成为C17H18NO3+时，误差为2.6×10-6，远小于C16H14NO4+时的误差，MS/MS谱中主要碎片离子m/z分别为77.039 8、95.049 1、105.033 1、106.036 4。m/z 77为酮咯酸[M+H-C9H9NO3]+碎片离子，m/z 105为酮咯酸[M+H-C8H9NO2]+特征碎片离子，证明其含有苯环上连接羰基的结构单元。参考BP 2015推测其结构如图 20(即BP杂质J)，推测其可能裂解途径推测如图 21。
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图 20 有关物质22的推测分子结构 Figure 20 Proposed chemical structure of related substance 22 |
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图 21 有关物质22可能的裂解途径 Figure 21 Fragmentation pathway of related substance 22 |
如“2.2”项中所述，现行标准对酮咯酸氨丁三醇及酮咯酸氨丁三醇注射液有关物质进行检测的色谱条件中，除色谱柱类型外，其余条件均一致。其中中国国家药品标准YBH04032007、BP 2015、EP 8.0、USP 38均采用C8柱，而中国国家药品标准YBH40282005、YBH02492009、YBH03222006、YBH02462009、YBH40752005-2014Z、YBH03762014则采用C18柱。
按“2.2”项下列出的3种色谱条件(包括酮咯酸氨丁三醇注射液含量测定色谱条件)，对“2.3.1”项下的系统适用性溶液和“2.3.3”项下的溶液进行试验，溶液中各杂质检出结果详见表 2。
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表 2 现行标准检查有关物质结果 Table 2 Results of related substances by HPLC-UV |
流动相①条件下，在C18与C8柱上获得的酮咯酸氨丁三醇系统适用性、酮咯酸氨丁三醇原料药及注射液样品有关物质检查典型图谱见图 22、23。将系统适用性溶液在此色谱条件下所得色谱图与HPLC-DAD-MS实验结果对应，对图上峰进行了标号。C8柱出峰与C18柱出峰顺序一致。
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10. 1-羟基酮咯酸(ketorolac 1-hydroxy analog)13.未知杂质(unknown impurity)15. 1-酮基酮咯酸(ketorolac 1-keto analog)21.未知杂质(unkonwn impurity) A.系统适用性溶液[system suitability solution]B.酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot No.506150406)]C.酮咯酸氨丁三醇注射液(山东新时代药业有限公司，批号035150201)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot No.035150201)] 色谱条件：Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；流动相：0.05 mol·L-1磷酸二氢铵溶液(甲酸调节pH至3.0)-四氢呋喃(70:30)；流速：1.0 mL·min-1；二极管阵列检测器检测波长：313 nm[chromatography conditions：Waters Xbridge C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；column temperature：40 ℃；mobile phase：0.05 mol·L-1 ammonium dihydrogen phosphatesolution(adjust with phosphoric acid to pH 3.0)and tetrahydrofuran(70:30)；flow rate：1.0 mL·min-1；detector：DAD 313 nm] 图 22 供试品溶液流动相①系统(现行标准)C18柱检测色谱图 Figure 22 Chromatograms of test solutions on C18 column(mobile phase ①) |
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10. 1-羟基酮咯酸(ketorolac 1-hydroxy analog)13.未知杂质(unknown impurity)15. 1-酮基酮咯酸(ketorolac 1-keto analog)21.未知杂质(unkonwn impurity) A.系统适用性溶液[system suitability solution]B.酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot No.506150406)]C.酮咯酸氨丁三醇注射液(山东新时代药业有限公司，批号035150201)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot No.035150201)] 色谱条件：Merck Purospher STAR RP-8e C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；流动相：0.05 mol·L-1磷酸二氢铵溶液(甲酸调节pH至3.0)-四氢呋喃(70:30)；流速：1.0 mL·min-1；二极管阵列检测器；检测波长：313 nm[chromatography conditions：Merck Purospher STAR RP-8e C8(250 mm×4.6 mm，5 μm)；column temperature：40 ℃；mobile phase：0.05 mol·L-1 ammonium dihydrogen phosphate solution(adjust with phosphoric acid to pH 3.0)and tetrahydrofuran(70:30)；flow rate：1.0 mL·min-1；detector：DAD 313 nm] 图 23 供试品溶液流动相①系统(现行标准)C8柱检测色谱图 Figure 23 Chromatograms of test solutions on C8 column(mobile phase ①) |
流动相①条件下，各厂家生产的各批号原料药与注射液样品中1-羟基酮咯酸(杂质10)和杂质21均未检出，相对保留时间为1.1的杂质(RRT 1.1，杂质13)在部分样品中有检出，但检出量很少；各企业和原料药主要检出杂质为1-酮基酮咯酸(杂质15)和相对保留时间为0.5(RRT 0.5)的杂质，其量虽有超过0.10%的，但均不超过0.1%，其他单个最大杂质量也均不超过0.1%，杂质总量均未超过0.3%。对比C8柱与C18柱检测结果，C8柱检出大于0.05%的杂质原料药有3个，注射液有3个，C18柱检出大于0.05%的杂质原料药有4个，注射液有3个，均包括液质联用方法检出的大于0.05%的杂质，可见现标准对于有关物质的检测并未漏检。C18柱检测的杂质数与杂质量比C8柱检测结果均略高，但两者检测结果没有显著差异。
流动相②条件下，在C18柱上获得的酮咯酸氨丁三醇系统适用性、酮咯酸氨丁三醇原料药及注射液样品典型图谱见图 24。各厂家生产的各批号原料药与注射液样品有关物质检查见表 2。其中因检测波长的变化，该条件在表 2中有关物质峰含量的数据为未乘校正因子所得到的结果。
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10. 1-羟基酮咯酸(ketorolac 1-hydroxy analog)13.未知杂质(unknown impurity)15. 1-酮基酮咯酸(ketorolac 1-keto analog)21.未知杂质(unkonwn impurity) A.系统适用性溶液[system suitability solution]B.酮咯酸氨丁三醇(山东新时代药业有限公司，批号506150406)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot No.506150406)]C.酮咯酸氨丁三醇注射液(山东新时代药业有限公司，批号035150201)[ketorolac tromethamine(Shandong Newtime Pharmaceutical Co.，Ltd，lot No.035150201)] 色谱条件：Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相：甲醇-水-冰醋酸(55:44:1)；流速：1.0 mL·min-1；二极管阵列检测器检测波长：254 nm[chromatography conditions：Waters Xbridge C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；column temperature：30 ℃；mobile phase：methanol，water and glacial acetic acid(55:44:1)；flow rate：1.0 mL·min-1；detector：DAD 254 nm] 图 24 供试品溶液流动相②系统(现行标准)C18柱检测色谱图 Figure 24 Chromatograms of test solutions on C18 column(mobile phase ②) |
本研究在制定液质方法条件时，对流动相比例以及流动相的pH均进行了摸索。在研究过程中，采用了现行注射液标准中含量测定的液相色谱条件对系统适用性溶液进行了检查，发现主峰与有关物质能够完全分离，但各有关物质峰之间分离度不理想，此流动相pH为3.3，因此考虑制定的液质联用方法的流动相pH应更小才能将各有关物质峰分离。比较了流动相pH分别为3.0和2.5的图谱，结果显示pH 2.5时有关物质峰与主峰分离效果更好。
当有机相与水相比例为30:70时，杂质峰出峰较慢，而当有机相与水相比例为40:60时，主峰与主要杂质峰出峰时间较为适宜；因此最终选择以0.05 mol·L-1乙酸铵溶液(甲酸调节pH至2.5)-乙腈(60:40)为流动相。但由于流动相pH较小，原料药在酸性条件下难溶，所以在对原料药有关物质进行检测时，用同比例的水与乙腈混合溶液作为溶剂。
4.2 强制降解供试溶液及系统适用性溶液检测结果的讨论液质联用系统主要考察强制降解供试溶液结果，强制降解浓度根据USP供试品溶液浓度配制。由于杂质对照品价格较贵，所以未采用杂质对照品进一步确认杂质。液质联用考察强制降解试验结果显示，酮咯酸氨丁三醇原料药在光和氧化条件下容易被破坏，而在碱性、酸性及高温条件下较为稳定，由此可以得知在药物的贮存和制剂处方设计与工艺摸索中要特别注意避光和避免被氧化。
对系统适用性溶液的配制进行过多次，可以确定得到的为1-羟基酮咯酸(杂质10)和1-酮基酮咯酸(杂质15)，另外杂质21也能在每次实验中得到，但杂质13在有些实验中出现，在有些实验中未出现，此杂质可在光破坏和氧化破坏中得到，其在文献[19]中有报道，样品中有检出但量非常小，不超过0.02%。系统适用性溶液的使用主要是为了定位1-羟基酮咯酸与1-酮基酮咯酸，杂质13与杂质21的出现不影响系统适用性溶液的使用，但对它们的进一步研究，对充分了解酮咯酸氨丁三醇的降解途径具有参考价值。
本实验系统适用性溶液除1-酮基酮咯酸、1-羟基酮咯酸外还检出杂质13、杂质21以及相对保留时间为0.5的杂质，而USP 38和BP 2015中除1-酮基酮咯酸、1-羟基酮咯酸及相对保留时间为0.5的杂质外还对一相对保留时间约为0.66的杂质峰(BP杂质D)有具体限度规定，此杂质在本实验的系统适用性和供试品溶液中均没有出峰。
4.3 原料药及注射液的供试品溶液检测结果的讨论对国内各药品生产企业生产的酮咯酸氨丁三醇原料药与注射液产品的有关物质考察结果显示，各产品主要的共有杂质为有关物质4(USP杂质A)、6、15(1-酮基酮咯酸)、18。而1-酮基酮咯酸(有关物质15)在注射液中的含量相比其原料药有明显增加，结合破坏试验，1-酮基酮咯酸在各破坏条件下均能产生，在氧化和光破坏中产生量明显较多，可以得出结论，在原料药、注射剂的生产质量管理过程中要特别注意对1-酮基酮咯酸的含量的监测。
对比国内检出的杂质与国外药典所规定杂质可以发现，除共有的杂质4、10、15、21、22以外，本研究中还发现了文献未报道过的杂质1、6、13，提示可以对这些杂质进行进一步研究。
对比现有标准中收录的各种有关物质与含量测定色谱条件，本文选定采用现行标准中所收录的有关物质检查流动相条件来对酮咯酸氨丁三醇及注射液的有关物质进行控制，并将色谱柱确定为C18柱。
5 结论本研究开发了新的液相色谱条件用于酮咯酸氨丁三醇及其注射剂中有关物质的高分辨质谱检测，并对8个主要杂质进行了结构推测，该方法能够全面灵敏地检测出该品种的各种有关物质。本研究还对酮咯酸氨丁三醇及其注射液的有关物质进行了检查，并与液质联用方法的检测结果进行了对比。这对完善药品质量标准，加强药品质量管理监控有重要意义。
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