2017, Vol. 37 
单克隆抗体在其复杂的生产及存储过程中能产生大量的修饰和改变，如氧化/脱酰胺[1]、糖基化[2]、C末端赖氨酸截除[3]、N末端焦谷氨酸环化[4]等，造成抗体在电荷分布方面的异质性，这些修饰对抗体活性、免疫原性及药代动力学均有影响，同时也是整个生产工艺的重要指征。因此电荷变异体是抗体质控中关注的重点，对其进行有效的质量控制是十分必要的。
目前，对抗体电荷异质性分析的常用方法有等电聚焦电泳(IEF)、离子交换色谱(IEC)[5]、毛细管区带电泳(CZE)[6]、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)[7]和成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)[8]。等电聚焦电泳(IEF)是根据抗体总的电荷差异进行分离；IEC中除了总电荷差异外，电荷的分布由于能够影响抗体与色谱柱的相互作用，也会影响电荷变异体的分离检测；CZE根据样品各组分的质荷比差异进行分离。上述方法均能对单抗样品的电荷异构体进行有效的分离，并具有各自的优势。pI是蛋白质的固有属性，通常测定方法有IEF以及CIEF和iCIEF，CIEF和iCIEF由于快速、准确、通用性强等特点，在单抗pI测定中较为常用。
由于以上常用的电荷异质性分析方法在分离机制上存在差异，对单抗异质性的分析可能会存在差异；同时，目前国内申报单位对治疗性单抗制品拟定质量控制方案时，忽略或尚未足够重视对单抗电荷异质性的有效控制。本研究通过对IEC、CZE、CIEF和iCIEF 4种常用电荷异质性分析方法进行比较研究，旨在探讨不同电荷异质性检测方法的差异及在质量控制中的重要性。
1 材料和方法 1.1 材料抗TNFα全人源单克隆抗体样品，由本室保存，置换缓冲液为20 mmol·L-1的Tris缓冲液，pH.0。
十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，分析纯，购自Sigma公司。氯化钠(NaCl)，分析纯，购自Sigma公司。超纯水：电阻率不低于18.2 MΩ·cm，本研究中所有溶液均用超纯水配制。
Waters公司e2695高效液相色谱仪，UV检测器。Absciex公司PA800 plus系统毛细管电泳仪，UV检测器。ProteinSimple公司iCE280系统成像毛细管等电聚焦电泳仪。Absciex公司Absciex N-CHO涂层毛细管(有效长度20 cm，内径50 μm，聚乙烯醇类涂层)。Thermo公司ProPac WCX-10色谱柱(4 mm×250 mm，固定相为羧酸盐)。GE公司3-10两性电解质。
1.2 IEC分析色谱柱：ProPac WCX-10(4 mm×250 mm，固定相：羧酸盐)；流动相：A相为0.01 mol·L-1磷酸氢二钠水溶液(称取3.58 g Na2HPO4·12H2O，加水900 mL溶解，用稀磷酸溶液调节pH至7.5，纯水定容1 000 mL，用0.22 μm滤膜过滤，超声脱气后使用)，B相为0.01 mol·L-1磷酸氢二钠和0.5 mol·L-1氯化钠水溶液(称取3.58 g Na2HPO4·12H2O和29.22 g NaCl，加水900 mL溶解，用稀磷酸溶液调节pH至5.5，纯水定容至1 000 mL，用0.22 μm滤膜过滤，超声脱气后使用。)，洗脱梯度(0~20 min，6%B→16%B；20~22 min，16%B→100%B；22~26 min，100%B)；流速：1.0mL·min-1；上样量：100 μL(1mg·mL-1)；检测波长：280 nm。
1.3 CZE分析用纯水将样品稀释至0.5 mg·mL-1，6.895 kPa进样10 s，然后以40 mmol·L-1的ε-氨基己酸-0.2%的羟丙基甲基纤维素为电泳缓冲液，30 kV电压下分离15 min，检测波长214 nm，毛细管有效长度40 cm，总长50 cm，内径50 μm。
1.4 CIEF分析混合200 μL的3 mol·L-1尿素CIEF胶、12 μL的3-10两性电解质、20 μL的阴极稳定剂、2 μL的阳极稳定剂、2 μL的pI marker和10 μL的纯水稀释后的样品溶液(质量浓度5 mg·mL-1)172.375 kPa进样99 s，然后在25 kV电压下聚焦15 min，25 kV电压下化学移动30 min，检测波长280 nm，毛细管有效长度20 cm。
1.5 iCIEF分析将10 μL的纯水稀释后的样品溶液(质量浓度5 mg·mL-1)与70 μL的1%甲基纤维素、1 μL的pI marker 5.12、1 μL的pI marker 9.77、8μL的3-10两性电解质、40μL的8 mol·L-1尿素和70 μL超纯水混匀。预聚焦电压1.5 kV，持续1 min；聚焦电压3 kV，持续10 min。
1.6 理论pI计算通过抗TNFα全人源单克隆抗体一级序列，在Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server(http://web.expasy.org/compute_pi/)[9]计算其理论pI值。
2 结果 2.1 电荷异构体比例分析用IEC、CZE、CIEF和iCIEF 4种方法分别对抗TNFα全人源单克隆抗体的电荷异质性进行了分析，结果如图 1所示，抗TNFα全人源单克隆抗体呈典型的单抗电荷异质性分布，表现为主峰及其左右两侧的酸、碱性峰。由于分离机制的差异，酸、碱性峰的出峰顺序有所不同，在IEC和iCIEF方法下，出峰顺序依次为酸性峰、主峰和碱性峰；CZE和CIEF方法下，出峰顺序依次为碱性峰、主峰和酸性峰。主峰及酸碱峰峰面积百分比见表 1和图 2。
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A. IEC B. CZE C. iCIEF D. CIEF 图 1 抗TNFα全人源单克隆抗体电荷异质性分析图谱 Figure 1 Chromatograms of charge heterogeneity analysis of human recombinant anti-TNF α monoclonal antibody |
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表 1 抗TNFα全人源单克隆抗体电荷异质性分析(mean±s，n=3) Table 1 Analysis of charge heterogeneity of human recombinant anti-TNF α monoclonal antibody |
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图 2 抗TNFα全人源单克隆抗体电荷异构体峰面积百分比 Figure 2 Peak area percentage of charge isomers of human recombinant anti-TNF α monoclonal antibody |
结果显示，IEC和CZE 2种方法检测的电荷异构体比例较为一致，4种方法检测的碱性峰比例较一致，CIEF和iCIEF检测的主峰与酸性峰面积比例较其他方法具有一定的差异。
2.2 主峰等电点分析利用CIEF和iCIEF 2种方法对单抗样品的主峰pI进行了检测，(CIEF条件：3-10两性电解质，聚焦15 min，pI marker分别为4.1、5.5、7.0和10.0；iCIEF条件：3-10两性电解质，聚焦10 min，pI marker分别为5.12和9.77)，结果如表 2所示。2种方法检测得到的主峰pI差异较大，CIEF法的pI为8.36，iCIEF法的pI为8.99。该抗体的理论pI为8.36。
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表 2 不同聚焦时间对pI值分析的影响(mean±s，%，n=3) Table 2 Analysis of pI value by different focusing times |
为了评价CIEF和iCIEF中主峰pI检测的影响因素，采用不同聚焦时间和选择不同的pI marker进行分析。由于2种方法聚焦条件存在差异，首先分析了在不同聚焦时间对pI测定的影响。由图 3-A和表 2可见，聚焦时间长短对pI的测定具有较大的影响。CIEF模式下随着聚焦时间的增加，毛细管内pH梯度线性减弱，R2值减小(10 min聚焦时pH线性梯度最好，但聚焦不完全，推荐采用聚焦15 min)，样品主峰pI不断减小，pI marker聚焦位置向样品两端扩散。而对于iCIEF，样品主峰pI随着聚焦时间增加不断增加，2个pI marker位置较为固定(图 3-B和表 2)。
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图 3 不同聚焦时间下CIEF(A)及iCIEF(B)分析 Figure 3 Analysis of CIEF(A) and iCIEF(B) by different focusing time |
对于不同pI marker对样品主峰pI值测定的影响，在聚焦15 min的CIEF模式下进行了分析，结果如表 3所示。当选取样品pI两端的marker进行计算时，不同pI值以及所用marker数量的选择对样品的pI值计算有一定影响，但影响不大(在约0.1 pI范围内)，而pI marker均在样品一侧时，测定的样品pI值差异较大。因此，建议在pI测定时，选取样品pI两端与其pI值较接近的marker进行测定。
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表 3 不同pI marker对主峰pI值计算的影响(mean±s，%，n=3) Table 3 Effect of different pI markers oncalculation of pI value of main peak |
虽然2种方法测定的pI值差异较大，但同一种方法内其测定电荷异构体比例和pI值却较稳定，因此这2种方法均适用于单抗的电荷异质性分析和鉴别(根据图谱或pI值)，对于2种方法在pI值测定上的差异，将在今后进一步进行研究。
3 讨论抗体电荷异质性的分析，能够更好地保证产品的批间一致性，同时也能够发现由生产工艺的变化引起的抗体电荷分布的改变，从而对整个生产流程进行监测，并能推动对生产工艺的优化，保证抗体的安全有效性，因此在抗体质控和放行中进行电荷异质性分析十分必要。
抗体电荷异质性常规分析方法包括IEC、IEF以及CIEF和CZE。平板等点聚焦电泳法操作烦琐，分辨率比较低，定量不准确；IEC、CIEF和iCIEF具有较好的分辨率及定量优势，CIEF在抗体药物偶联物(ADC)中未偶联抗体的检测也有一定的应用[10]；CZE通用性强、分析时间短，且具有相当的分离度和准确性。其中IEC [11]和CZE[12]可与MS兼容进一步对电荷异构体进行表征。上述方法由于分离机制的不同，分别从不同的角度对抗体电荷变异体进行描述[13-15]。
本研究对目前较常使用的IEC、CIEF、iCIEF和CZE 4种电荷异质性方法进行了比对分析，结果表明这些方法能够对单抗的电荷异构体进行有效分离和定量。对本研究中采用的抗TNFα全人源单克隆抗体，4种方法在电荷异构体比例和等电点测定上存在一定的差异。根据质量源于设计的理念，企业应结合产品特性和表征数据，对电荷异构体与抗体活性、免疫原性及体内药代等方面的关联进行评价，从而选择合理的分析方法、设定产品合理科学的质量标准，以保证产品的有效性和安全性。
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