2017, Vol. 37 
2. 浙江中医药大学基础医学院, 杭州 310053
2. College of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310053, China
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在体外可向骨骼肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化，是细胞和组织工程的理想种子细胞[1]。MSCs动员是指应用动员剂或采用动员措施促使骨髓中的MSCs释放并迁移到外周血，参与损伤修复及组织再生等[2]。此举具有体外细胞移植修复损伤无法比拟的低创性和高效性，应用前景广阔。正常生理状态下，循环中的MSCs含量极少[3]，且目前仍缺乏临床行之有效的MSCs动员措施。国内外研究者们曾采用造血干细胞动员剂动员MSCs，结果不太令人满意[4-5]。
脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase，PHD）抑制剂—二甲基二乙酰基（dimethyloxaloylglycine，DMOG）是一种小分子酮戊二酸类似物，其在干细胞成骨分化、新生血管形成等过程中具有促进作用[6]。前期研究发现：缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是MSCs动员的关键因子，在MSCs动员中起中心作用，且DMOG对MSCs具有动员作用，其可通过上调HIF-1信号通路将MSCs动员至外周血[2, 7]。而DMOG动员后的外周血间充质干细胞（peripheral blood mesenchymal stem cells，PB-MSCs）是否仍具有多向分化潜能，有待进一步研究。
本研究将通过大鼠腹腔注射DMOG，诱导MSCs动员至外周血，研究DMOG动员后PB-MSCs的多向分化潜能。研究结果将为MSCs动员剂的开发提供新的理论依据和实验基础。
1 实验动物与材料 1.1 细胞供体MSCs培养的外周血供体为健康SD大鼠，清洁级，4周龄，体重（80±10）g，雄性，由浙江中医药大学动物实验中心提供[SYXK（浙）2008-0115]，来源于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK（沪）2008-0016]。
1.2 主要试剂药品及主要试剂：DMOG（Cayman公司）；DMEM/F-12培养基、LG-DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶青霉素-链霉素（Gibco公司）；PBS磷酸盐缓冲剂（0.01 mol·L-1，pH=7.4）、淋巴细胞分离液（北京鼎盛生物技术公司）；成脂诱导分化培养基A/B、成软骨诱导分化培养基（含TGF-β3细胞因子）套装、油红O储存液（赛业生物科技有限公司）；β-巯基乙醇、β-磷酸甘油、维生素C、甲苯胺蓝染料、硝酸银（Sigma公司）；地塞米松（Cayman公司）。抗体：兔抗大鼠CD34-FITC抗体、兔抗大鼠CD90-PE抗体、兔抗大鼠CD45-FITC抗体、荧光抗体同型对照、抗大鼠Nestin一抗、抗大鼠GFAP一抗（Santa Cruz公司），FITC标记二抗（联科生物公司），免疫染色洗涤液、免疫染色固定液、免疫染色分泌液、DAPI染液（达文生物公司）。
2 实验方法 2.1 细胞提取取5只雄性SD大鼠腹腔注射DMOG 40 mg·kg-1，连续给药7天，第7天后，10%水合氯醛（3.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，无菌条件下，10 mL注射器从腹主动脉取血5 mL，根据密度梯度离心法用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，2 000 r·min-1离心20 min后，提取白雾层，添加白雾层5倍体积的PBS离心（1 500 r·min-1，10 min），洗涤细胞2次，最后一次离心后去掉上清，即得到外周血单个核细胞。
2.2 PB-MSCs的培养和扩增取上述的外周血单个核细胞，重悬于5 mL DMEM/F-12培养基中（含10%FBS、1%青-链霉素），接种到25 cm2的塑料培养瓶，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，5天后更换新鲜培养液，弃去未贴壁的细胞继续培养，以后每3天换1次液。当细胞生长接近90%融合时，按1:3比例进行传代培养，即得到外周血单个核细胞。按上述培养方法将得到的细胞培养至第4代并进行后续实验使用。
2.3 PB-MSCs的免疫表型检测将第4代外周血单个核细胞消化计数后，取5×105个·mL-1的外周血单个核细胞用PBS 100 μL重悬于流式管，同时设置异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）与藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）同型对照组，每组5管。每管细胞加入兔抗大鼠CD90-PE抗体5 μL、兔抗大鼠CD45-FITC抗体2 μL和兔抗大鼠CD34-PE抗体5 μL。室温避光条件孵育30 min后，PBS 1mL洗去未结合抗体，流式细胞仪检测CD34、CD45和CD90的表达。
2.4 PB-MSCs成骨定向分化潜能检测成骨诱导分化培养基：用LG-DMEM基础培养基配制含β-磷酸甘油10 mmol·L-1、地塞米松0.1 μmol·L-1、维生素C 50 μmol·L-1和FBS 10%的成骨诱导分化培养基，总体积1 000 mL，0.22 μm针头式滤器过滤除菌。取第4代5×105个·mL-1 PB-MSCs（“2.3”项中已鉴定），弃去旧培养基，每孔加入PBS 1 mL洗涤2次，加入成骨诱导分化培养基2 mL，置于37 ℃培养箱继续培养，以后每3天换1次成骨诱导分化培养基；14 d后，弃去成骨诱导分化培养基，用4%多聚甲醛固定30 min，硝酸银染液染色5 min，紫外照射30 min，每孔加入5%硫代硫酸钠溶液2 mL，染色2 min后用PBS 1 mL冲洗2次，倒置相差荧光显微镜下检测。
2.5 PB-MSCs成软骨定向分化潜能检测取培养的第4代PB-MSCs（“2.3”项中已鉴定）弃去旧培养基，以PBS 1 mL洗涤2次后，消化计数，以5×104个·mL-1重悬于新鲜配制的成软骨诱导分化培养基于6孔板中培养，每孔加入2 mL细胞悬液，放入37 ℃、CO2培养箱继续培养，待细胞融合接近80%后，去掉旧培养基，PBS洗涤2次，最后加入培养基套装中的TGF-β3细胞因子100 μL，6孔板置于37 ℃培养箱继续培养，以后每3天换1次成软骨诱导分化培养基，同时加入TGF-β3细胞因子100 μL。培养诱导分化21 d后，弃去诱导分化培养基，以PBS 1 mL洗涤2次，4%多聚甲醛固定60 min，甲苯胺蓝染液染色30 min，倒置相差荧光显微镜下检测。
2.6 PB-MSCs成脂定向分化潜能检测取第4代的PB-MSCs（已鉴定）弃去旧培养基，以PBS 1 mL洗涤2次后，消化计数，以1×106个·mL-1重悬于含1%青-链霉素、10%FBS的DMEM/F-12培养基中，6孔板培养细胞，每孔加入细胞悬液2 mL，置于37 ℃、CO2培养箱继续培养。待细胞融合接近90%后，弃去旧培养基，以PBS洗涤2次，每孔加入成脂诱导分化培养基A 2 mL，置于37 ℃、CO2培养箱继续培养，3 d后，换用成脂诱导分化培养基B 2 mL培养1 d后，再用成脂诱导分化培养液A 2 mL继续培养。培养基A和培养基B交替作用3~5次，继续用培养基B维持培养4~7 d，直到脂滴变得足够大、圆。随后用4%多聚甲醛500 μL固定30 min，以PBS洗涤2次后，每孔加入油红O 2 mL染色30 min，以PBS充分洗涤，倒置相差荧光显微镜下检测。
2.7 PB-MSCs成神经定向分化潜能检测成神经分化预诱导液：用LG-DMEM基础培养基配制含β-巯基乙醇1 mmol·L-1，FBS 20%的成神经定向分化培养基，总体积1 000 mL，0.22 μm针头式滤器过滤除菌。成神经分化诱导液：用LG-DMEM基础培养基配制含β-巯基乙醇5 mmol·L-1，FBS 20%的成神经定向分化培养基，总体积1 000 mL，0.22 μm针头式滤器过滤除菌。
细胞爬片制作：取第4代的PB-MSCs（已鉴定）以5×105个·mL-1重悬于含10% FBS、1%青-链霉素的DMEM/F-12培养基中，取细胞悬液200 μL滴加到盖玻片上（盖玻片置于6孔板中），放入37 ℃培养箱培养。待细胞融合接近80%后弃去培养基，每孔加入新鲜配制的神经分化预培养基2 mL培养。24 h后，弃去神经分化预诱导液，PBS充分冲洗，换用神经分化培养基2 mL继续培养6 h，并在诱导1、3、6 h时间点观察细胞状态。弃去诱导分化培养液，每孔PBS 2 mL洗涤5 min重复2次，每孔加固定液2 mL固定15 min，弃去固定液，PBS 2 mL洗涤2次，每次5 min，封闭液1 mL封闭90 min，弃去封闭液并用滤纸吸干多余液体，加入封闭液稀释50倍的巢蛋白（Nestin）或100倍的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic peotein，GFAP）一抗工作液1 mL，室温孵育60 min后，弃去一抗工作液，再加入稀释100倍的FITC二抗工作液1 mL室温避光孵育30 min，洗涤液洗涤2次，每次5 min，倒置相差荧光显微镜下检测。
3 结果 3.1 DMOG动员后PB-MSCs的免疫表型分析通过流式细胞术检测PB-MSCs表面CD34、CD45及CD90的表达情况，结果显示PB-MSCs造血系标记CD34（0.37±0.38）%及CD45（0.20±0.10）%阴性表达，而CD90（98.50±2.18）%阳性表达（图 1）。
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图 1 PB-MSCs表面标记物的表达结果 Figure 1 Expression results of PB-MSCs surface markers |
成骨诱导分化液诱导PB-MSCs 1 d后，细胞形态生长形态呈成纤维样无显著变化（图 2-A）；成骨诱导PB-MSCs分化7 d后，细胞排列紧密，逐渐失去细胞结构，呈多边形状，细胞外开始有颗粒状物体分泌（图 2-B）；成骨诱导PB-MSCs分化14 d后，已看不出明显的细胞形态，细胞开始融合，细胞外分泌许多钙盐，形成钙结节（图 2-C）。硝酸银染色结果发现：细胞被染成许多黑色颗粒，结果呈阳性（图 2-D）。以上结果表明：DMOG动员后的PB-MSCs具有成骨分化潜能。
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图 2 PB-MSCs的成骨分化结果 Figure 2 Osteogenic results differentiation of PB-MSCs |
成软骨诱导分化液诱导PB-MSCs 1 d后，细胞生长形态呈成纤维样无显著变化（图 3-A）；诱导PB-MSCs分化7 d后，PB-MSCs胞质开始收缩，典型的成纤维样开始消失，部分细胞变为圆形或椭圆形，细胞外有少量颗粒分泌（图 3-B）；诱导PB-MSCs分化21 d后，PB-MSCs胞质进一步收缩，细胞呈不规则形态，胞质外有大量折光性基质分泌（图 3-C）。甲苯胺蓝染色发现：细胞外基质被染成紫色，细胞核被染成深蓝色（图 3-D）。通过以上结果分析得到：DMOG动员后的PB-MSCs具有成软骨分化潜能。
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图 3 PB-MSCs的成软骨分化结果 Figure 3 Cartilage differentiation results of PB-MSCs |
成脂诱导PB-MSCs分化1 d后，细胞生长形态呈成纤维样无显著变化（图 4-A）；成脂诱导PB-MSCs分化7 d后，细胞质收缩，细胞开始变圆，典型的成纤维样开始消失，排列无序（图 4-B）；成脂诱导PB-MSCs分化21 d后，胞浆中出现充满大小不一的折光性脂滴，细胞排列无序且失去细胞轮廓（图 4-C）。油红O染色发现：细胞中的脂滴均被染成红色（图 4-D）。以上结果表明：DMOG动员后的PB-MSCs具有成脂分化潜能。
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图 4 PB-MSCs的成脂分化结果 Figure 4 Adipogenic differentiation results of PB-MSCs |
预诱导液诱导PB-MSCs 24 h后，细胞生长形态呈成纤维样无显著变化（图 5-A）；诱导液诱导PB-MSCs 1 h后，细胞形态无显著变化（图 5-B）；诱导液诱导PB-MSCs 3 h后，细胞形态变化明显，典型的成纤维样开始消失，细胞质开始收缩，细胞质外分泌许多圆形颗粒，部分细胞伸出长短不一的轴突（图 5-C）；诱导液诱导PB-MSCs 6 h后，PB-MSCs已经失去原有的MSCs形态，细胞大小不一，大多数胞体呈圆形的核周体形态，细胞质继续收缩，周围可见折光性较强颗粒，轴突末端出现一级和二级分支，相互延伸并形成网状，呈典型的神经元样细胞（图 5-D）。免疫荧光结果发现：Nestin表达阳性（图 5-E），GFAP阴性表达（图 5-F）。以上结果表明：DMOG动员后的PB-MSCs具有成神经分化潜能。
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图 5 PB-MSCs成神经分化结果 Figure 5 Neural differentiation results of PB-MSCs. |
MSCs是干细胞家族的重要成员，在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、神经、肌肉、心肌、内皮等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于细胞移植治疗、组织工程治疗等。前期研究发现：HIF-1α是缺氧诱导MSCs动员的关键因子，在MSCs动员过程中起中心作用[8]。而DMOG作为PHD的小分子抑制剂，通过抑制PHD的活性，而抑制HIF-1α的降解，稳定HIF-1α的表达，上调HIF-1信号通路[9-10]。前期研究证实：DMOG通过上调HIF-1α，从而调控其下游SDF-1/CXCR4通路与VEGF/VEGFR通路，从而诱导MSCs动员[2]。本研究通过探讨DMOG动员后大鼠PB-MSCs的多向分化潜能，以评价DMOG作为动员剂的可行性，为MSCs动员剂的开发提供理论基础和实验依据。
本研究依据密度梯度离心法，采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，培养DMOG动员后的PB-MSCs。已有研究表明，MSCs不表达造血细胞的标志CD34和CD45[11]，而阳性表达CD73、CD90和CD105等[12]，由于缺乏高度特异性表面标志物，可联合应用多种抗体帮助鉴定MSCs，CD34、CD45和CD90是鉴定MSCs的常用标志物[13-15]。通过流式细胞术检测DMOG动员的MSCs免疫表型，结果显示MSCs造血系标记CD45（0.20±0.10）%、CD34（0.37±0.38）%为阴性表达，而CD90（98.50±2.18）%阳性表达。证明了本研究中DMOG动员后的外周血细胞是MSCs。
在多向分化方面，通过形态观测、特殊标志物检验来研究DMOG动员后的PB-MSCs的成骨、成软骨、成脂肪和成神经细胞分化的能力。结果显示，PB-MSCs成骨标志物和硝酸银染色结果均呈阳性，证实动员后的PB-MSCs具有成骨分化能力。在PB-MSCs成软骨分化中，细胞形态观察和染色结果证实诱导后的PB-MSCs是软骨细胞。在成脂方面，“脂滴”和油红O染色结果证实DMOG动员后的PB-MSCs是脂肪细胞。成神经分化常通过神经干细胞表面的标记蛋白Nestin和GFAP鉴定[16]，DMOG动员后的PB-MSCs免疫荧光结果显示，Nestin阳性表达，GFAP阴性表达，表明其具有成神经分化的能力。
综上所述，脯氨酸羟化酶抑制剂DMOG动员后的大鼠PB-MSCs具有成骨、成软骨、成脂肪、成神经细胞分化的能力，进一步明确了动员剂DMOG的可行性，为其临床应用提供了一定的理论依据和实验基础，为动员剂的开发提供新路径。
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