2017, Vol. 37 
2. 安徽省地质实验研究所, 合肥 230011;
3. 浙江医药股份有限公司新昌制药厂, 新昌 312500;
4. 浙江大学药学院, 杭州 310058
2. Anhui Research Institute of Geological Experiment, Hefei 230011, China;
3. Xinchang Pharmaceutical Plant, Zhejiang Medicine Co., Ltd., Xinchang, 312500, China;
4. College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
三甲基氢醌是工业上合成维生素E的重要中间体，与异植物醇侧链缩合反应得维生素E。维生素E作为重要的抗氧化剂，主要应用于医药、食品、饲料及化妆品的添加剂。目前德国巴斯夫、迪斯曼以及浙江新和成和浙江医药四大公司的维生素E占据全球95%的市场份额[1]。杂质产生机理，杂质结构确证和杂质限度控制是药品质量的重要研究内容。杂质研究现在已发展成一个体系，利用现代仪器设备和各种复杂的分析测试手段可以分离提纯和富集产品中极微量的有关物质，并进行结构确证。目前对三甲基氢醌合成工艺路线及催化剂方面研究较多[2-5]，对其工艺中产生的杂质关注报道较少[6]。本文主要对合成维生素E的重要中间体三甲基氢醌，通过两次制备方法，获得纯度较高的2种杂质，并对杂质进行了质谱及二维核磁共振光谱的测定。
杂质的研究与其工艺密切相关[7-16]。三甲基氢醌原料合成工艺采用间甲酚(m-cresol)甲基化后得2，3，6-三甲基苯酚(TMP)，经氧化得2，3，5三甲基苯醌(TMQ)，经还原得2，3，5-三甲基氢醌(TMHQ)，工艺路线见图 1。实验所用的样品经高效液相色谱分析(图 2)，以归一化法计算其相对纯度达到99%以上，其中大于0.1%的杂质有杂质1(0.102%)，杂质3(0.524%)和杂质5(0.118%)；杂质2、杂质4和杂质6含量均小于0.05%。杂质5为三甲基氢醌的合成原料(即氧化产物三甲基苯醌)，因此本研究对含量较高的未知杂质1和未知杂质3进行分离提纯制备及结构鉴定。
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图 1 三甲基氢醌合成工艺路线图 Figure 1 Synthetic process of trimethylhydroquinone |
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图 2 三甲基氢醌起始原料、中间体及有关物质色谱图 Figure 2 Chromatograms of starting material, intermediates and related impurities from trimethylhydroquinone |
Agilent 1200 HPLC高效液相色谱仪；Shimadzu LC-20 AP半制备色谱仪，Gilson-215型高通量半制备色谱；Agilent HPLC1260-QTof 6520液相色谱四极杆飞行时间高分辩质谱仪；BrukerAvance 400 MHz超导核磁共振仪。
分析用试剂甲醇、乙腈为色谱级，其他均为试剂级，间甲基苯酚(含量99.3%，批号150403)，三甲基苯酚(含量99.2%，批号150405)、三甲基氢醌(含量99.2%，批号150408)及三甲基苯醌(含量99.4%，批号150407)样品由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供。
2 试验方法 2.1 液相色谱分析样品采用安捷伦公司Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×150 mm，5μm；填料：十八烷基硅烷化学键合多孔硅胶，双封端)色谱柱，以水(磷酸调节pH至2.5)-甲醇(45:55)为流动相进行等度洗脱，流速0.8 mL·min-1，柱温25℃，DAD检测器(检测波长280 nm)，分析时间为15 min；三甲基氢醌样品以流动相溶解并现用现配。
2.2 杂质初次色谱制备采用岛津公司Shimadzu LC-20 AP半制备色谱仪，以菲罗门公司SynergiPolar-RP C18 (250 mm×50 mm，10 μm；填料：极性端基封尾的醚连接的苯基相硅烷化学键合多孔硅胶)色谱柱，以乙腈溶解配制100 mg·mL-1三甲基氢醌样品，每次进样量为8 mL，以水(A)-乙腈(B)为流动相，进行梯度洗脱[0 min(90%A-10%B)→25 min(65%A-35%B)→32 min(28%A-72%B)→32.01 min(100%B)→37 min(100%B)→37.01 min(90%A-10%B)]，流速80 mL·min-1，柱温25℃，DAD检测器(254 nm和280 nm)，平衡时间为5 min；分别在22~28 min和31~33 min收集洗脱液，即得杂质1和杂质3的制备液(见图 3)。杂质1的制备液直接采用减压旋蒸脱溶剂后进行冻干富集，即得杂质1粗品；杂质3的制备液采用固相萃取分离(Cleanert PEP SPE柱，规格为60 mg/3 mL，天津博纳艾杰尔公司)，将富集的杂质3组分加3倍体积水稀释，稀释液以1 mL·min-1加入SPE柱，用6 mL纯化水洗柱，用少量二氯甲烷洗脱后常温挥发有机相，即得杂质3粗品。
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图 3 杂质1和杂质3的第一次制备分离图谱 Figure 3 The 1st preparative liquid chromatogram of impurity 1 and 3 from TMHQ |
采用Gilson-215型高通量半制备色谱仪，以水(A)-乙腈(B)为流动相，流速25 mL·min-1，柱温为室温，DAD检测器(220和254 nm)，运行时间为15 min；对杂质1粗品用乙腈溶解，以天津博纳艾杰尔AgellaVenusil ASB C18 (150 mm×21.2 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷化学键合多孔硅胶，不封尾)色谱柱，进行梯度洗脱[0 min(95%A-5%B)→1.5 min(95%A-5%B)→11 min(65%A-35%B)→11.2 min(100%B)→13.8 min(100%B)→14 min(95%A-5%B)]，收集9.5~10.5 min洗脱液得高纯度杂质1制备液(见图 4-A)；对杂质3粗品以乙腈溶解，以菲罗门公司Phenomenex Gemini C18(150 mm×25 mm，10 mm；填料：十八烷基硅烷化学键合多孔硅胶)色谱柱，梯度洗脱[0 min(95%A-5%B)→1.5 min(78%A-22%B)→11 min(48%A-52%B)→11.2 min(100%B)→13.8 min(100%B)→14 min(95%A-5%B)]，收集9.5~10.6 min洗脱液得高纯度杂质3制备液(见图 4-B)；二次制备液富集浓缩处理同“2.2”项，分别得杂质1精制品和杂质3精制品。
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图 4 杂质1(A)和杂质3(B)的第二次制备分离图谱 Figure 4 The 2nd preparative liquid chromatogram of impurity 1(A) and impurity 3(B) from TMHQ |
将2.3所得杂质1精制品和杂质3精制品分别用水-乙腈(45:55)溶解分别进样；采用Agilent HPLC1260-QTof 6520液质联用仪器，使用Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×150 mm，5μm；填料：十八烷基硅烷化学键合多孔硅胶，双封端)色谱柱，以含0.075%三氟乙酸的超纯水-含0.025%三氟乙酸的乙腈(45︰55)为流动相等度洗脱，流速0.8 mL·min-1，柱温设定为25℃，检测器为DAD检测器(280 nm和220 nm)和质谱检测器。质谱参数为ESI离子源，正离子扫描模式，喷雾气压力为3.103×105 Pa，干燥气温度为350℃，干燥气氮气流速为10 L·min-1，毛细管电压4 000 V，裂解电压Fragmentor为70 V，碰撞电压CE为20 V。
2.5 核磁共振分析Bruker公司AVANCE 400超导核磁共振仪；5 mm BBO探头；1H谱频率为400.13 MHz，13C谱频率为100.61 MHz。将1.5 mg杂质1精制品溶解在约1 mL氘代乙腈中，然后转移到核磁管；将约30 μL杂质3精制品溶解在约600 μL氘代氯仿中，然后转移到核磁管。通过1H-NMR、13C-NMR、DEPT135、HSQC、COSY、HMBC、NOE二维核磁共振谱表征以确定杂质的结构式。
3 结果与讨论 3.1 高效液相色谱定性研究三甲基氢醌通常采用气相色谱检测方法控制产品的质量[4]，本研究需要制备杂质，因此采用高效液相色谱检测。三甲基氢醌溶液稳定性较低，三甲基氢醌氧化成杂质5，即三甲基苯醌的峰面积会逐渐升高，对未知杂质的定性及结构鉴定研究，三甲基氢醌样品采用现用现配以减少杂质5的产生。避免引入新杂质，液相色谱方法中未引入还原剂抑制三甲基氢醌样品氧化[6]。从色谱图 1明显看出，杂质1和杂质3是主要杂质，因此分离制备杂质1和杂质3。
3.2 杂质制备分离与纯化三甲基氢醌中杂质1和杂质3含量较低，均在0.1%左右，一次制备难以获得高纯度杂质进行结构鉴定(质谱及核磁检测)，因此从三甲基氢醌样品中制备高纯度杂质1和杂质3需要进行两次分离纯化制备。初次制备采用加大上样量方法，截流含大部分杂质的洗脱液。尽管初次洗脱液中杂质成分纯度较低，但组分较简单，便于二次制备高纯度杂质。对初次制备含杂质1粗品的洗脱液采用低温旋蒸脱去有机溶剂，再经冷冻干燥处理后进行第二次制备纯化，一次制备液相色谱见图 3。实验发现杂质3粗品未能通过旋蒸冻干富集，可能由于杂质3熔点低挥发性强，在旋蒸时与有机溶剂一起挥发而未能富集。因此杂质3采用固相萃取方法进行富集浓缩，将高纯度杂质3的洗脱液过SPE小柱后，用二氯甲烷洗脱后，二氯甲烷(沸点较低)自然挥发后得油状液体杂质3精制品。
3.3 质谱分析杂质1精制品质谱结果见图 5，液相色谱峰纯度约为97.5%，说明杂质1纯度较高，高分辨质谱显示[M+H]+为m/z 139.075 7，安捷伦MassHunter Workstation软件推测分子式C8H10O2，其相对分子质量与检测值误差为1.81×10-6，不饱和度为4；与三甲基氢醌相比，该分子式的相对分子质量小14，推测其与三甲基氢醌为同系物，可能为二甲基取代物。
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图 5 杂质1液相色谱(A)、质谱图(B)二级质谱图(C) Figure 5 Liquid chromatogram(A), mass spectrum (B) and MS/MS spectrum (C) of impurity 1 |
杂质3精制品质谱结果见图 6，液相色谱峰纯度约为99.1%，说明杂质3纯度极高，高分辨质谱显示[M+H]+为m/z 153.091 1，安捷伦MassHunter Workstation软件推测其分子式C9H12O2，该分子式与三甲基氢醌分子式相同；其相对分子质量与检测值误差为1.78×10-6，不饱和度DBE为4；杂质3的紫外光谱与三甲基氢醌的紫外光谱对比，三甲基氢醌的紫外光谱在280 nm处有最大吸收值，而杂质3最大吸收值在254 nm。推测杂质3的结构与三甲基氢醌有较大的差异。
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图 6 杂质3液相色谱(A)、质谱图(B)及二级质谱图(C) Figure 6 Liquid chromatogram(A), mass spectrum (B) andMS/MS spectrum (C) of impurity 3 |
杂质1精制品核磁共振谱分析，1H-NMR(CD3CN，400 MHz) δ：6.49 (s，2H)，6.09(s，2H)，2.06(s，6H)；13C-NMR(CD3CN，100 MHz)，δ：148.71，123.00，117.95，15.81；Dept-135显示在δ值为117.95和15.81有正峰，说明这两处δ值的碳谱是1级或3级碳原子；碳氢相关HSQC图谱在碳谱δ值15.81与氢谱δ值2.06处有关联，碳谱δ值117.95与氢谱δ值6.49处有关联；氢氢相关COSY图谱在δ值为2.06和6.49近程耦合相关。
杂质3精制品核磁共振谱分析，1H-NMR(CD3Cl3，400 MHz) δ：2.89 (m，2H)，2.54(m，1H)，1.98(m，6H)，1.15(m，3H)；13C-NMR(CD3CN，100 MHz)，δ：200.36，197.39，145.84，145.30，44.95，41.69，16.21，13.21，12.70；Dept-135显示在δ值为41.69，16.21，13.21，12.70有正峰，说明此δ值的碳谱是1级或3级碳原子；Dept-135显示在δ值为44.95有负峰，说明此δ值的碳谱是2级碳原子；碳氢相关HSQC图谱在碳谱δ值16.21与氢谱δ值1.15处有关联，碳谱δ值13.21与氢谱δ值1.98处有关联，碳谱δ值41.69与氢谱δ值2.89处有关联，碳谱δ值44.95与氢谱δ值2.89处有关联，碳谱δ值44.95与氢谱δ值2.54处有关联；氢氢相关COSY图谱在δ值为2.89和2.54是近程耦合；δ值为2.89和1.16也是近程耦合。
3.5 结构鉴定综合分析杂质1精制品与三甲基氢醌的紫外光谱相似，质谱分子量相差14，核磁共振谱中，氢谱均呈现单峰，且所有的氢谱化学位移值均重复，碳谱中的化学位移值呈4个值，而质谱中显示碳原子数为8个，表明该分子化学结构是对称的。结合三甲基氢醌的合成路线分析，表明该杂质分子是2，5-二甲基氢醌或2，3-二甲基氢醌。从核磁共振二维氢氢相关COSY光谱分析表明2，3-二甲基氢醌中δ值为2.06和6.49近程耦合作用很弱，因此确定该杂质的结构式为对称性的2，5-二甲基氢醌。
杂质3精制品与三甲基氢醌的紫外光谱差异较大，其相对分子量与三甲基氢醌相同，核磁中2个碳谱化学位移值在200附近，另2个碳谱化学位移值在145附近，推测该化合物应该含2个羰基和1个碳碳双键，分子结构式不饱和度为4，以及另2个碳原子化学位移值在40附近，表明该杂质仍是一环状结构；由于氢的化学位移值均在高场，因此不存在双键上含氢，根据DEPT135判断，环上存在CH2结构和1个CH结构，综合判断分析该结构为2，3，5-三甲基-2-环已烯-1，4-二酮，化学结构式见图 7。
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图 7 杂质1和杂质3的化学结构式 Figure 7 Chemical structures of impurity 1 and impurity 3. |
杂质1精制品的二级质谱离子峰显示该化合物可以裂解成质荷比(m/z)124.10，91.00，77.00等碎片峰，推测该化合物应含有苯环结构(m/z 77.00离子碎片峰)，甲基苯环结构(m/z 91.00离子碎片峰)，m/z 124.10(C8H10O丢失1个甲基峰)。杂质3精制品的二级质谱碎片离子峰为m/z 125.2，107.20，79.20，55.20，从这些碎片离子峰分析，其结构中应不含苯环结构。图 8表示2个杂质的二级质谱裂解可能形成的碎片离子方式。
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图 8 杂质1和杂质3的二级质谱裂解方式 Figure 8 Possible mechanism of MS/MSspectra from impurity 1 and impurity 3 |
中间体或原料药中存在的极微量的有关物质研究，根据色谱分析结果，通过半制备色谱进行大批量富集，依据物理化学性质选择合适的方法分离富集制备出高纯度样品，通过色谱、质谱、紫外光谱及二维核磁共振光谱进行结构鉴定，本工艺中生产的三甲基氢醌中2个杂质分别是2，5-二甲基氢醌和2，3，5-三甲基-2-环已烯-1，4-二酮。
| [1] |
杜红. 2015年维生素类原料药出口分析[J]. 精细与专用化学品, 2016, 24(7): 5. DU H. Analysis of Chinese vitamins export in 2015[J]. Fine and Spec Chem, 2016, 24(7): 5. |
| [2] |
白元盛, 李子成, 王立新, 等. 2, 3, 5-三甲基氢醌的合成研究[J]. 合成化学, 2014, 22(3): 423. BAI YS, LI ZC, WANG LX, et al. Research progress on the synthesis of 2, 3, 5-trimethylhydroquinone[J]. Chin J Synth Chem, 2014, 22(3): 423. |
| [3] |
柳东明, 李荀, 臧恒昌. 维生素E母核合成研究进展[J]. 大学化学, 2015, 30(3): 26. LIU DM, LI X, ZANG HC. Research advance in the synthesis of vitamin E nucleus[J]. Univ Chem, 2015, 30(3): 26. DOI:10.3866/pku.DXHX2010326 |
| [4] |
钱东, 唐成国, 杨礼义, 等. 2, 3, 5-三甲基氢醌的气相色谱测定及其对合成过程中催化剂性能的评价[J]. 化学试剂, 2005, 27(4): 220. QIAN D, TANG CG, YANG LY, et al. Gas chromatography of 2,3, 5-trimethylhydroquinone and evaluation method of catalyst during its synthesis[J]. Chem Reagents, 2005, 27(4): 220. |
| [5] |
张天永, 尹观, 李彬, 等. Raney-Ni催化加氢合成2,3, 5-三甲基氢醌的研究[J]. 应用化工, 2013, 42(8): 1363. ZHANG TY, YIN G, LI B, et al. Preparation of 2, 3, 5-trimethylhydroquinone by catalytic hydrogenationof 2, 3, 5-trimethylbenzoquinone on Raney-Ni catalyst[J]. Appl Chem Ind, 2013, 42(8): 1363. |
| [6] |
杨国红, 张玉珍, 张茹英, 等. RP-HPLC测定三甲基氢醌的含量[J]. 天然气化工, 2006, 31(4): 63. YANG GH, ZHANG YZ, ZHANG RY, et al. RP-HPLC determination of 2, 3, 5-trimethylhydroquinone[J]. Nat Gas Chem Ind, 2006, 31(4): 63. |
| [7] |
RAMAN B, SHARMA BA, MAHALE G, et al. Investigation and structural elucidation of a process related inpurity in candesartancilexetil by LC/ESI-ITMS and NMR[J]. J Pharm Biomed Anal, 2011, 56(2): 256. DOI:10.1016/j.jpba.2011.05.024 |
| [8] |
WANG BL, WAN GH, WANG E, et al. Isolation and structure characterization of related impurities in sodium tanshinone Ⅱ A sulfonate by LC/ESI-MS and NMR[J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 67-68(1): 36. |
| [9] |
AWASTHI A, RAZZAK M, AL-KASSAS R, et al. Separation and identification of degradation products in eprinomectin formulation using LC, LTQ FT-MS, H/D exchange, and NMR[J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 63(1): 62. |
| [10] |
RAMAN B, SHARMA BA, BUTALA R, et al. Structural elucidation of a process-related impurity in ezetimibe by LC/MS/MS and NMR[J]. J Pharm Biomed Anal, 2010, 52(1): 73. DOI:10.1016/j.jpba.2009.12.021 |
| [11] |
PROVERA S, ROVATTI L, TURCO L, et al. A multi-technique approach using LC-NMR, LC-MS, semi-preparative HPLC, HRNMR and HR-MS for the isolation and characterization of low-level unknown impurities in GW876008, a novel corticotropin-release factor 1 antagonist[J]. J Pharm Biomed Anal, 2010, 53(3): 517. DOI:10.1016/j.jpba.2010.06.012 |
| [12] |
RAMAN B, SHARMA BA, GHUGARE PD, et al. Semi-preparative isolation and structural elucidation of an impurity in citalopram by LC/MS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal, 2009, 50(3): 377. DOI:10.1016/j.jpba.2009.05.017 |
| [13] |
王成刚, 刘照振, 王亚男, 等. HPLC法测定氟康唑的有关物质及最大未知杂质结构鉴定[J]. 药物分析杂志, 2016, 36(7): 1243. WANG CG, LIU ZZ, WANG YN, et al. HPLC determination of related substances and the largest unknown impurity in fluconazole[J]. Chin J Pharm Anal, 2016, 36(7): 1243. |
| [14] |
李文东, 王成刚, 王俊秋, 等. 国产罗红霉素杂质谱及与合成工艺相关性评价[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(2): 320. LI WD, WANG CG, WANG JQ, et al. Evaluation of relativity between impurity profile and synthesis technology of domestic roxithromycin[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(2): 320. |
| [15] |
ZHANG DF, SONG X, SU JT. Isolation,identification and structure elucidation of two novel process-related impurities of retigabine[J]. J Pharm Biomed Anal, 2014, 99: 22. DOI:10.1016/j.jpba.2014.06.023 |
| [16] |
KUMAR N, DEVINENI SR, GAJJALA PR. Four process-related potential new impurities in ticagrelor:identification, isolation, characterization using HPLC, LC/ESI-MSn, NMR and their synthesis[J]. J Pharm Biomed Anal, 2016, 120: 248. DOI:10.1016/j.jpba.2015.12.037 |