2017, Vol. 37 
草珊瑚为金粟兰科草珊瑚属植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥全草，在我国福建、江西、广西及台湾等地均有分布，为福建省道地药材。其味苦、辛，性平，归心、肝经，具有清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，常用于治疗多种炎症疾病、跌打损伤以及肿瘤[1-4]。现代研究表明，草珊瑚主要含有香豆素、有机酸、黄酮、挥发油等类化学成分[5-9]，2015年版中国药典在质量控制中只要求异嗪皮啶与与迷迭香酸的含量分别不得少于0.02%。但在优良品种选育时只检测这2种成分很难反映草珊瑚药材质量的总体水平，本试验检测了香豆素、有机酸以及黄酮等类药效组分物质，其中的黄酮苷成分如槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷具有良好的抗氧化、抗炎、预防心血管疾病等作用[10-12]，体现草珊瑚多组分、多靶点、多途径的临床治疗优势。在课题组前期研究中，首次从闽产草珊瑚中分离获得上述2种黄酮类成分。对于草珊瑚中常见有效成分的研究已有文献报道[13-15]，但未见使用高效液相色谱法同时测定草珊瑚中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷与山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等9个有效成分的含量测定研究。本研究同时比较不同产地的草珊瑚中9个有效成分的含量差异，为草珊瑚的优良品种选育提供参考依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1200 series高效液相色谱仪：真空脱气机、四元泵、柱温箱、紫外检测器、HP1200化学工作站（美国安捷伦科技有限公司）；数控超声波清洗器KQ-500DE型（昆山市超声仪器有限公司）；HANCPING型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国，Millipore公司）。DIKMA Diamonsil十八烷基硅烷键合硅胶（C18）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。
1.2 试药新绿原酸（批号：P27A6F2713）、绿原酸（批号：R05F6F1）、隐绿原酸（批号：Z30A6B2）、咖啡酸（批号：Y17D6C7672）、落新妇苷（批号：P04D6F6929）、异嗪皮啶（批号：Y28J5S1）、迷迭香酸（批号：P05M6R3）均购自上海源叶生物科技有限公司；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷均为本实验室自制，面积归一化法计算纯度均大于99.0%。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯（天津市福晨化学试剂厂），水为自制超纯水，其余试剂均为分析纯。
草珊瑚药材共17批，采自17个不同产地，经福建中医药大学药学院车苏容副教授鉴定为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥全草，来源见表 1。
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表 1 草珊瑚样品来源 Table 1 Source of the test samples of Sarcandrae Herba |
精密称取落新妇苷对照品适量，用甲醇溶解，配制成82.0 μg·mL-1的对照品溶液。精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异嗪皮啶、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸的对照品适量，加甲醇溶解，配制成含新绿原酸71.4 μg·mL-1、绿原酸91.3 μg·mL-1、隐绿原酸93.2 μg·mL-1、咖啡酸80.4 μg·mL-1、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷42.4 μg·mL-1、异嗪皮啶93.4 μg·mL-1、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷48.8 μg·mL-1、迷迭香酸94.7 μg·mL-1混合对照品溶液，即得。
2.2 供试品溶液制备取草珊瑚样品粉末（过四号筛）约2.0 g，精密称定，置250 mL烧瓶中，加甲醇50 mL，浸泡30 min，称量，加热回流2 h，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，提取液浓缩至适当体积，放置室温，转移至25 mL容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 色谱条件色谱柱：DIKMA Diamonsil十八烷基硅烷键合硅胶（C18）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0~20 min，2% A→15% A；20~23 min，15% A→12.5% A；23~42 min，12.5% A；42~70 min，12.5% A→30% A）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：290 nm（检测落新妇苷），344 nm（检测新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异嗪皮啶、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸）；进样量：10 μL，在该色谱条件下，9个成分与其他相邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于4 000，对照品及样品（三明三元楼源）的色谱图见图 1。
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1.落新妇苷（astilbin）2.新绿原酸（neochlorogenic acid）3.绿原酸（chlorogenic acid）4.隐绿原酸（cryptochlorogenic acid）5.咖啡酸（caffeic acid）6.槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（quercetin-3-O-β-D-glucuronide）7.异嗪皮啶（isofraxidin）8.山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（kaempferol-3-O-β-D-glucuronide）9.迷迭香酸（rosmarinic acid） 图 1 对照品（A、B）与三明三元楼源草珊瑚样品（C、D）HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A, B)and samples No.11(C, D) |
精密吸取“2.1”项下落新妇苷对照品溶液0.5、1、5、10、20、25 μL进样分析，以峰面积（Y）为纵坐标，以进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，落新妇苷的回归方程及线性范围见表 2；精密吸取“2.1”项下其他成分的对照品溶液0.5、2、5、10、20、25 μL进样分析，以峰面积（Y）为纵坐标，以进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，各成分的回归方程及线性范围见表 2。
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表 2 9个活性成分的回归方程及线性范围 Table 2 Regression equations and linear ranges of nine active components |
取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果落新妇苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异嗪皮啶、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸的RSD（n=6）为1.5%、1.1%、0.88%、0.75%、0.88%、1.0%、1.4%、1.3%、0.67%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验精密称取同一来源草珊瑚药材（三明三元楼源）粉末约2.0 g，共6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件进样，记录峰面积。结果落新妇苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异嗪皮啶、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸的平均含量分别为0.80、0.29、0.96、0.85、0.34、0.50、0.67、0.59、1.14 mg·g-1，RSD分别为0.89%、1.7%、1.4%、1.2%、1.5%、1.3%、1.6%、1.6%、0.91%。表明方法重复性良好。
2.4.4 稳定性试验取同一供试品溶液（三明三元楼源），在0、2、4、8、12、24 h分别按“2.3”项下色谱条件进样，记录峰面积，结果落新妇苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异嗪皮啶、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸的峰面积RSD（n=6）分别为0.66%、0.52%、1.0%、0.69%、0.60%、0.74%、1.3%、1.2%、0.63%，表明供试品溶液中上述9个成分在24 h内稳定。
2.4.5 加样回收率试验精密称取已知含量的草珊瑚药材粉末（三明三元楼源）1.0 g，共6份，分别精密加入一定量的对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率，结果见表 3。
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表 3 9个活性成分的加样回收率试验结果（n=6） Table 3 The results of recoveries of nine components |
精密称取17个不同来源的草珊瑚样品粉末约2.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算落新妇苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异嗪皮啶、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸的峰面积的含量，结果见表 4。
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表 4 17批样品中9个活性成分的含量（mg·g-1，n=3） Table 4 The content of nine active components of seventeen samples |
本试验检测了草珊瑚中9个有效成分，结果表明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷与山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷在不同的地区含量具有较明显的差别，在三明三元区的草珊瑚品种中上述2种黄酮苷含量较其他产地草珊瑚中含量高，且在三元区草珊瑚中异嗪皮啶与迷迭香酸均含量较高，绿原酸等其他5个成分在各产地中含量差别较小。草珊瑚为福建道地药材，具有质优、疗效好的特点，本试验选取的9个有效成分可为福建道地药材草珊瑚的优良品种选育提供参考。
3.2 检测波长的选择本试验所测9个成分落新妇苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、异嗪皮啶、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸，其最大的紫外吸收波长不尽相同，为保证每个指标成分都具有较高的灵敏度，能准确地测定各成分含量，利用DAD检测器进行全波长扫描，落新妇苷的最大吸收波长为290 nm，而在344 nm时吸收较小，其余8种成分，在344 nm处均有较好的吸收，故选择290 nm检测落新妇苷，选择344 nm检测其余8个有效成分。
3.3 提取条件的选择本试验考察了草珊瑚药材的超声提取法和加热回流方法，结果表明采用超声提取法，提取率较低，本实验选择加热回流的方法，提取时间为2 h，提取1次。
3.4 流动相的选择本试验首先采用乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，结果表明其分离效果不好，个别峰出现较严重拖尾现象；以乙腈-0. 2%磷酸水溶液为流动相，分离效果较为理想。试验同时考察了甲醇-水系统，结果表明该系统分离效果不及乙腈-磷酸系统，故本试验采用乙腈-0.2%磷酸水为流动相。采用等度洗脱时，其他成分会相互干扰，而采用梯度洗脱时，各有效色谱峰较好，分离良好，故选择梯度洗脱。
4 小结本文通过考察试验过程中HPLC检测方法优化，建立了同时测定草珊瑚中9个有效成分含量测定的方法，此9个有效成分为17个产地的草珊瑚的共有成分，福建三元区草珊瑚所含的9个成分含量均较高，根据所测的上述有效成分及草珊瑚生物量综合考察，成功选育1个草珊瑚优良品种。该方法简便易行，稳定可靠，可为进一步完善草珊瑚的质量控制提供依据。
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