2017, Vol. 37 
2. 四川省烟草质量监督检测站, 成都 610041
2. Sichuan Tobacco Quality Supervision and Testing Station, Chengdu 610041, China
他莫西芬（tamoxifen，TAM）是非甾体选择性雌激素受体调节剂，主要通过和体内的雌激素竞争乳腺癌细胞的雌激素受体（oestrogen receptor）而达到抑制肿瘤细胞生长的作用，临床上广泛应用于乳腺癌和卵巢癌的治疗[1]。他莫西芬口服后吸收迅速，体内主要经细胞色素P450（CYP）3A4和CYP2D6等酶代谢转化成N-去甲基-他莫西芬（N-desmethyl-tamoxifen，N-Des-TAM）、4-羟基-他莫西芬（4-hydroxy-tamoxifen，4-OH-TAM）和4-羟基-N-去甲基-他莫西芬（4-OH-N-demethyl-tamoxifen，En-doxifen，EDF）[2]。其中，4-OH-TAM和EDF是具有比母体药强30~100倍药理活性的代谢产物[3-5]。
TAM及其活性代谢产物的检测分析方法，国内外都有报道，主要基于液相色谱法（HPLC）[6-8]、胶束液相色谱法（MLC）[9]和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[10-14]。在检测复杂基质中的药物代谢物时，填有亚微米的小粒径固定相的超高效液相色谱具有较高的分离度，因而受到了广泛关注，近年来，也有人选取超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）快速测定干血斑[15]和血浆样品[16]中TAM及其活性代谢物。HPLC法灵敏度不高和选择性不够，限制了其同时测定血浆中TAM及其代谢产物的能力。国内虽然有报道采用UPLC-MS/MS同时测定血浆样品中TAM及代谢产物的浓度和应用，但是仍使用粒径为5μm的常规色谱柱，其分离度不如粒径为1.7 μm的色谱柱高；只采用了原型药物的氘代内标；且样品处理采用固相萃取法，此法不及蛋白沉淀法简便、快捷[17]。
本研究在以往研究的基础上，建立一种快速、灵敏、简便、取样量少的UPLC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中TAM及其主要活性代谢物的浓度，旨在为临床前评价药物对CYP3A酶活性的影响及可能的药物相互作用提供快速、简便的分析技术。
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图 1 他莫西芬（A），4-羟基-他莫西芬（B），4-羟基-N-去甲基-他莫西芬（C）的化学结构式 Figure 1 The chemical structures of TAM(A), 4-OH-TAM(B)and EDF(C) |
Xevo TQTM超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司），配备电喷雾电离源（ESI）；涡旋振荡器（VtexMixer 230VeU，美国Labnet公司）；MassLynx 4.1色谱工作站；离心机（Sigma 3K15，德国Sigma公司）；IKA Vortex Genius涡漩混合仪（德国IKA公司）；HGC-36A氮吹仪（上海泉岛科贸有限公司）；PCD-Ⅱ-10型超纯水机（成都品成科技有限公司）。
色谱柱Atiantis UPLC BEH Shield RP18（填料：十八烷基硅烷键合硅胶；50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters仪器公司）。
1.2 药品与试剂对照品：（Z）-他莫西芬（Toronto Research Ch-emical，目录编号：T006000，化学纯度：98%，多伦多，加拿大）、（Z）-4-羟基他莫西芬（Toronto Research Chemical，目录编号：H954725，规格：5 mg，化学纯度：98%，多伦多，加拿大）和4-羟基-N-去甲基-他莫西芬（Toronto Research Chemicals，目录编号：D292043，规格：5 mg，化学纯度：97%，多伦多，加拿大）；氘代内标：（Z）-他莫昔芬-d5（Toronto Research Chemical，目录编号：T006077，规格：1 mg，化学纯度：98%，同位素纯度：99.69%，多伦多，加拿大）、（Z）-4-羟基他莫昔芬-d5（Toronto Research Chemical，目录编号：H954757，规格：1 mg，化学纯度：98%，同位素纯度：99.7%，多伦多，加拿大）和4-羟基-N-去甲基-他莫昔芬-d5（Toronto Research Chemical，目录编号：D292044，规格：1mg，化学纯度：96%，同位素纯度：99.5%，多伦多，加拿大）；甲酸（HPLC级，批号：429380，美国DikmaPure公司）；甲醇（色谱纯，批号：3EF0057，Spectrum Chemical MFG. Co）；甲酸铵（HPLC级，批号：WC390060，CNW technologies）；水为去离子水。
1.3 实验方案 1.3.1 实验动物SD大鼠6只，雌性，体重为（200±20）kg，由成都达硕实验动物有限公司提供（生产许可证号：SCXK（川）2015-030）。
1.3.2 实验设计给药前大鼠禁食12 h，第二天以TAM 1.8 mg·kg-1（每日人用剂量按体表面积折算）的剂量单次灌胃给药，给药后12 h内不给予食物，并于给药前后0.00、0.08、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00、6.00、12.00、24.00、49.00、72.00、96.00 h断尾取血0.2 mL，全血置无菌肝素试管中，离心5 min（4 000 r·min-1），分离血浆，于-70 ℃保存待测。
2 方法 2.1 色谱及质谱条件 2.1.1 色谱条件色谱柱：Atiantis UPLC BEH Shield RP18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，USA）；流动相：A相为水（含3.5 mmol·L-1甲酸铵，甲酸调节pH到3.5），B相为甲醇（含3.5 mmol·L-1甲酸铵，甲酸调节pH到3.5）；梯度洗脱（0~0.5 min，10%B；0.5~1.1 min，10%B→90%B；1.1~2.0 min，90%B；2.0~2.01 min，90%B→10%B；2.01~3.0 min，10%B）；流速0.5 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量2 μL。
2.2.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI）；监测模式：正离子模式监测；扫描方式：多反应监测（MRM）。喷雾电压（IS）：2.6 kV；离子化温度：350 ℃；雾化气流量：1 000 L·h-1；锥孔气（cone）流量：50 L·h-1；碰撞气流量：0.15 mL·min-1；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间：30 ms，检测离子对及其相应的锥孔电压、碰撞能量（collision energy，CE）见表 1。
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表 1 ESI-MS/MS操作参数 Table 1 ESI-MS/MS operating parameters |
称取TAM对照品6.100 mg（照对照品标示含量计算约相当于TAM 5.978 mg），溶于甲醇制得0.597 8 mg·mL-1的储备液；称取4-OH-TAM对照品5.108 mg（照对照品标示含量计算约相当于4-OH-TAM 5.006 mg），溶于甲醇制得0.500 6 mg·mL-1的储备液；称取EDF对照品5.155 mg（照对照品标示含量计算约相当于EDF 5.004 mg），溶于甲醇制得0.500 4 mg·mL-1的储备液。分别称取的TAM-d5，4-OH-TAM-d5，EDF-d5对照品1.025 mg，1.023 mg，1.047 mg（照对照品标示含量计算约相当于TAM-d5 1.001 mg，4-OH-TAM-d50.999 5 mg，EDF-d5 1.000 mg），用甲醇分别溶解于不同的10 mL棕色量瓶中，定溶至刻度，制得浓度分别为100.1 μg·mL-1，99.95 mg·mL-1和100.0 μg·mL-1的内标储备液，-20℃储存备用，使用前将其恢复到室温。利用各个对照品储备液和内标储备液分别混合配制成9.568 μg·mL-1（以TAM的质量浓度计算）混合对照品工作溶液和10.01μg·mL-1（以TAM-d5的质量浓度计算）混合内标工作溶液；再用甲醇稀释混合对照品工作溶液，制成标准曲线系列工作溶液和质控工作溶液，4 ℃储存备用。其中标准曲线系列工作液中TAM的浓度为2.392、4.784、9.568、23.92、95.68、239.2、478.4、717.6、956.8 ng·mL-1，4-OH-TAM的浓度为1.252、2.504、5.008、12.52、50.08、125.2、250.3、375.4、500.6 ng·mL-1；EDF的浓度为1.251、2.502、5.004、12.51、50.04、125.1、250.2、375.3、500.4 ng·mL-1，质控工作溶液中TAM的浓度为2.392、4.784、478.4、765.4 ng·mL-1，4-OH-TAM的浓度为1.252、2.504、250.3、400.5 ng·mL-1，EDF的浓度1.251、2.502、250.2、400.3 ng·mL-1。
2.3 血浆样品处理精密吸取血浆50 μL，置于2 mL离心管中，精密加入内标工作溶液20 μL，甲醇20 μL，涡流混合30 s后加入130 μL甲醇涡流混合3 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液于1.5 mL离心管，30 ℃氮气吹干。残留物复溶于50 μL甲醇-水溶液（含3.5 mmol·L-1甲酸铵，甲酸调节pH到3.5，v/v：50:50），涡流混合1 min，12 000 r·min-1离心1 min，取上清液进样分析，进样量2 μL。
3 结果 3.1 方法学考察 3.1.1 专属性空白血浆、TAM、TAM-d5、4-OH-TAM、4-OH-TAM-d5和EDF、EDF-d5色谱图谱分别见图 2，3，4。由图可见，TAM、4-OH-TAM、EDF、TAM-d5、4-OH-TAM-d5和EDF-d5的峰形良好，保留时间分别约为2.04、1.92、1.98、2.04、1.92和1.98。空白血浆中内源性物质不干扰TAM、4-OH-TAM、EDF及相应内标的分离测定。
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A1. TAM的空白血浆（blank plasma for TAM）A2. TAM-d5的空白血浆（blank plasma for TAM-d5）B1.空白血浆（blank plasma）+1.914 ng·mL-1TAM B2.空白血浆（blank plasma）+ 400.4 ng·mL-1 TAM-d5 C1.大鼠灌胃1.8 mg·kg-1 TAM后49 h的血浆样品中TAM（TAM from a rat 49 h after intragastric administration of 1.8 mg·kg-1 TAM C2.大鼠灌胃1.8 mg·kg-1 TAM后49 h血管中TAM-d5（TAM-d5 from a rat 49 h after intragastric administration of 1.8 mg·kg-1 TAM） 图 2 血浆样品中TAM和TAM-d5色谱图 Figure 2 Chromatograms of TAM and TAM-d5 in plasma samples |
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A3. 4-OH-TAM的空白血浆（blank plasma for 4-OH-TAM）A4. 4-OH-TAM-d5的空白血浆（blank plasma for 4-OH-TAM-d5）B3.空白血浆（blank plasma）+ 1.002 ng·mL-1 4-OH-TAM B4.空白血浆（blank plasma）+ 199.9 ng·mL-1 4-OH-TAM-d5 C3.大鼠灌胃1.8 mg·kg-1 TAM后24 h的血浆中4-OH-TAM（4-OH-TAM from a rat 24 h after intragastric administration of 1.8 mg·kg -1 TAM）C4.大鼠灌胃1.8 mg·kg-1 TAM后24 h血浆中4-OH-TAM-d5（4-OH-TAM-d5 from a rat 24 h after intragastric administration of 1.8 mg·kg -1 TAM） 图 3 血浆样品中4-OH-TAM和4-OH-TAM-d5色谱图 Figure 3 Chromatograms of 4-OH-TAM and 4-OH-TAM-d5 in plasma samples |
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A5. EDF的空白血浆（blank plasma for EDF）A6. EDF-d5的空白血浆（blank plasma for EDF-d5）B5.空白血浆（blank plasma）+ 1.001 ng·mL-1 EDF B6.空白血浆（blank plasma）+ 200.0 ng·mL-1 EDF-d5 C5.大鼠灌胃1.8 mg·kg-1 TAM后2 h血浆中的EDF（EDF from a rat 2 h after intragastric administration of 1.8 mg·kg-1 TAM C6.大鼠灌胃1.8 mg·kg-1 TAM后2 h血浆的EDF-d5（EDF-d5 from a rat 2 h after intragastric administration of 1.8 mg·kg-1 TAM） 图 4 血浆样品中EDF和EDF-d5色谱图 Figure 4 Chromatograms of EDF and EDF-d5 in plasma samples |
取空白血浆50 μL，精密加入混合标准曲线系列工作溶液20 μL，即得质量浓度（以TAM的质量浓度计）分别为0.956 8、1.914、3.827、9.568、38.27、95.68、191.4、287.0和382.7 ng·mL-1的混合标准曲线血浆样品，按照“2.3”项下方法操作。对各标准样品峰面积（Aanalyte）与内标峰面积（AIS）的比值（R）和其浓度（C）进行线性回归分析，得到回归方程，结果见表 2。各种化合物浓度在其相应的线性范围内线性关系良好，可以满足定量分析的需要。
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表 2 线性范围，回归方程和相关系数 Table 2 Linear range, regression equations andcorrelation coefficient values |
按上述方法，每天平行配制TAM、4-OH-TAM、EDF质量浓度分别为0.956 8 ng·mL-1、0.500 8 ng·mL-1和0.500 4 ng·mL-1的含药血浆标准样品6份连续配制3 d，按照“2.3”项下方法操作。以S/N > 10，测得TAM在血浆中的定量下限（LLOQ）为0.956 8 ng·mL-1，RSD为6.6%（n=18）。4-OH-TAM在血浆中的定量下限（LLOQ）为0.500 8 ng·mL-1，RSD分别为5.4%（n=18）。EDF在血浆中的定量下限（LLOQ）为0.500 4 ng·mL-1，RSD为3.6%（n=18）
3.1.4 精密度与准确度制备含TAM质量浓度分别为1.914、191.4和306.2 ng·mL-1，且4-OH-TAM质量浓度分别为1.002、100.1和160.2 ng·mL-1，EDF质量浓度分别为1.001、100.1和160.1 ng·mL-1的低、中、高3个浓度的混合含药血浆标准样品，每个浓度平行制备6份，按照“2.3”项下方法操作，进行日内精密度、日间精密度和准确度（准确度用方法回收率表示）的考察，结果见表 3。TAM、4-OH-TAM、EDF低、中、高3个浓度的日内精密度RSD（n=6）分别为7.1%、6.2%、3.0%，8.1%、7.5%、6.1%，8.1%、6.1%、2.4%，日间精密度RSD（n=18）分别为6.8%、8.1%、5.8%，6.8%、4.4%、6.3%，6.8%、3.5%、8.1%，均小于15%，准确度在92.9%~113.2%之间，说明该方法准确、可靠、重复性好。
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表 3 准确度、精密度和回收率试验结果表（n=6） Table 3 esults of accuracy, precision and recovery |
记录精密度第1天低、中、高3个浓度（n=6）的TAM、4-OH-TAM、EDF的峰面积，以此作为标准样品提取后测定的峰面积。
精密吸取空白血浆50 μL，置于2 mL离心管中，精密加入甲醇40 μL，涡流混合30 s后加入130 μL甲醇涡流混合3 min，12 000 r·min-1离心5 min，取尽上清液，向上清液加入20 μL低、中、高浓度的混合对照品工作溶液（每个浓度平行操作6份）和混合内标工作溶液20 μL，于37 ℃氮气吹干。残留物复溶于50 μL甲醇-水溶液（含3.5 mmol·L-1甲酸铵，甲酸调节pH到3.5（50:50）中，涡流混合1 min，12 000 r·min-1离心1 min，取上清液进样测定。记录TAM、4-OH-TAM、EDF的面积，以此作为标准样品未提取测定的峰面积。
以不同浓度配制TAM、4-OH-TAM、EDF标准样品提取后测定的峰面积与相同浓度未提取测定的峰面积平均值之比计算回收率，结果见表 3。低、中、高3种浓度的血浆标准样品中TAM的萃取回收率（n=6）分别为（70.2±4.3）%、（72.2±4.5）%、（69.5±3.5）%，4-OH-TAM的萃取回收率（n=6）分别为（73.0±4.8）%、（74.7±3.1）%、（72.3±4.7）%，EDF的萃取回收率（n=6）分别为（70.3±2.7）%、（73.5±6.3）%、（75.3±1.9）%，均符合生物样品测定要求。
3.1.6 稳定性考察了低、中、高3个浓度质控标准样品处理后（4 ℃）24 h、血浆标准样品室温放置8 h、血浆标准样品冻融3次以及长期冷冻（-20 ℃）30 d条件下的稳定性，按照“2.3”项下方法操作，以测定值与理论值相比，结果见表 4，表明含药血浆标准样品在上述条件及时间内是稳定的。
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表 4 稳定性实验结果表（mean±SD /%，n=6） Table 4 Recovery results of stability |
选择6种不同来源的血浆（分别来自6只大鼠），选择低、中、高3种不同浓度（n=6）的混合对照品工作溶液，参照“3.1.5”项下标准样品未提取的做法得到Set 2。将TAM/4-OH-TAM/EDF的对照品工作溶液和内标工作溶液用甲醇稀释，使之与Set 2待测理论浓度一致，进样分析得峰面积，作为Set 1。
绝对基质效应评价：以不同来源样品Set 2中样品峰面积与Set 1中样品平均峰面积之比值计算基质效应因子（matrix factor，MF）；以待测物与内标MF的比值计算内标归一化基质效应因子（IS-normalized MF）。相对基质效应评价：多个样品获得的内标归一化基质效应因子计算变异系数，结果见表 5，均小于15%，说明基质对于未知样品测定结果准确度的影响可以忽略。
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表 5 基质效应结果表（mean±SD/%，n=6） Table 5 Results of matrix effect(MF) |
按1.8 mg·kg-1大鼠灌胃给予他莫西芬后，TAM、4-OH-TAM、EDF的平均血药浓度-时间曲线见图 5。Cmax和Tmax从平均血药浓度-时间曲线中直接读出。经DAS 3.2.7药动学统计软件对血药浓度经时数据进行处理，得到药动学参数，结果见表 6。
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图 5 大鼠单剂量灌胃他莫西芬1.8 mg·kg-1后的TAM（A）、4-OH-TAM（B）和EDF（C）平均血药浓度-时间曲线（n = 6） Figure 5 TAM(A), 4-OH-TAM(B)and EDF(C) mean blood concentration-time curves in rat following a single dose intragastric administration of 1.8 mg·kg-1 of TAM |
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表 6 大鼠单剂量灌胃他莫西芬后的药动学参数（mean±SD，n=6） Table 6 Pharmacokinetic parameters of rat after a single dose intragastric administration of 1.8 mg·kg-1 of TAM |
TAM及其代谢物中均有含氮基团，有利于结合质子得到正离子，因此选择正离子模式进行检测。选取常用的3种UPLC色谱柱（UPLC HSS T3，UPLC BEH Shield RP18和Atlantis dC18）以及液质分析常用的流动相体系（乙腈/水体系、甲醇/水体系以及加入不同量的甲酸和甲酸铵）优化色谱和流动相条件。试验结果显示待测化合物在UPLC BEH Shield RP18柱上，3.5 mmol·L-1甲酸铵水溶液（甲酸调节pH到3.5）和3.5 mmol·L-1甲酸铵甲醇溶液（甲酸调节pH到3.5）体系中具有更好的分离度与峰形，甲酸铵和甲酸的加入正好为TAM的离解过程提供了H+，有助于提高质谱离子化效率和信噪比；粒径为1.7 μm的色谱柱能在较短时间内实现多种化合物的极限分离，化合物的峰宽更窄。
本研究中大鼠口服TAM后的Tmax与文献[18-19]一致，符合大鼠口服TAM后3~6 h达到峰浓度[20]。4-OH-TAM的T1/2和Tmax分别与文献[11]和文献[18-19]一致；4-OH-TAM的代谢率（metubolite ratio，MR=AUC4-OH-TAM/AUCTAM）为（9.65±0.29）%，也与文献[21]接近。药动学参数结果显示本研究建立的测定方法能有效、准确地用于TAM及其代谢物的血药浓度测定和药动学研究。此外，方法学考察的结果显示该方法快速、灵敏、准确、选择性、重复性好，符合生物样品测定的要求；且血浆用量少，蛋白沉淀法操作简便，适用于TAM及其代谢物的血浆浓度测定，也可用于CYP3A酶活性的评价及药物相互作用的药动学研究。
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