2017, Vol. 37 
场流分离（field-flow fractionation，FFF）是Giddings博士于1966年提出的一种类似色谱的分离技术，是利用抛物线形流和垂直施加的外力场联合作用实现的[1]。根据被分析物不同的物理特性（如大小、密度、质量、电荷等），可分离表征粒径范围在几纳米到几百微米的大分子和颗粒[2-3]。根据外力场的不同，FFF可分为流场流分离、沉降场流分离、热场流分离、电场流分离等技术。其中沉降场流分离包括旋转沉降场流分离和重力场流分离，前者是以转子旋转产生的离心力作为外力，一般习惯称之为沉降场流分离（sedimentation field-flow fractionation，SdFFFF）[4]。
重力场流分离（gravitational field-flow fractionation，GrFFF）是利用重力作为外力场，这使其成为技术及原理上最简单的一种FFF技术，可在标准的色谱仪中实施。分离是在一个空的分离通道中进行的，样品除随载液纵向流动外，还存在垂直于通道方向的漂移运动，在平行于通道的水平推力和垂直方向重力和升力的综合作用下，依据自身属性（如粒径、密度和表面特性）的差别获得不同的空间位置和移动速率，从而实现分离[5-6]。GrFFF的应用范围十分广泛，可分离粒径从几微米到几百微米的颗粒，因其分离条件的温和性还可用于生物样品的分离。
本文对近年来重力场流分离技术的发展现状进行总结，以期为今后GrFFF的研究与应用提供一定的参考。
1 重力场流分离技术的原理 1.1 重力场流分离的设备和原理GrFFF的基本结构是基于一个从塑料或玻璃材料中切削出的“剑形”、扁平通道，夹在两平板玻璃间固定，可插入标准的低压液相色谱或流动注射分析仪（FIA）中，组成GrFFF系统[5, 7]，仪器示意图见图 1。分离原理是：样品进入分离通道后，受到垂直方向的重力、载液流动产生的升力及自身扩散力的综合作用。重力驱动样品向通道壁聚集靠拢，而反向作用的升力和扩散力则将样品推离积聚壁。当几种反作用力达到平衡时，样品将处于积聚壁上方一定高度的位置[4]。由于分离通道的宽高比很大，故通道内部液体的流动为层流，同时由于厚度很小，载液在通道内的流速剖面呈抛物线形或近似抛物线形，处于通道中心位置的组分流速最大，位于通道壁上的最小[8]。样品依据自身的大小、密度、形状、扩散性等物理特性的差别，将处于不同的空间位置因而获得不同的移动速度，从而实现分离[4]。分离原理见图 2。
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图 1 重力场流分离仪器示意图 Figure 1 Schematic view of the GrFFF instrument [7] |
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图 2 重力场流分离原理图 Figure 2 Schematic view of GrFFF separation principle[39] |
在GrFFF中，样品有3种洗提模式：一是标准洗提模式，又称布朗模式，多适用于粒径小于1 μm的微粒。这种模式下，样品的扩散作用较大，是平衡重力的主要因素，由于缺少升力作用，样品积聚作用较弱，导致峰变宽而影响分离效果；二是空间洗提模式，又称立体模式。这种模式下，样品受到的重力远大于其他反向作用力，颗粒紧贴积聚壁，故移动速度较小；三是聚焦洗提模式，又称超层模式，这种模式下的样品受到的流体动力升力（HLF）较大，HLF使样品远离通道壁并形成窄的区带，此时重力与HLF相平衡。标准洗提模式下，直径较小的颗粒先洗脱，直径较大的颗粒后洗脱；而空间和聚焦洗提模式的洗脱顺序恰恰相反，直径较大的颗粒先于直径较小的颗粒洗脱[4]。
在GrFFF中，颗粒除自身的扩散作用外，还受到重力和HLF等外力作用。重力的有效作用力为[4]：
| ${{F}_{G}}=GVp\Delta p=\frac{4}{3}{{r}^{3}}\Delta pG$ | (1) |
其中G是重力加速度，VP是颗粒体积，是颗粒密度与载液密度的差值，r是颗粒半径。由式（1）可知，可通过改变载液密度来改变作用于颗粒的有效重力[9]。
HLF由两部分组成，一是由于载液流动惯性引起的惯性升力FLi，二是由于微粒接近积聚壁时造成的近壁升力FNW，且有下式[4]：
| ${F_{{\rm{Li}}}} = 13.5\frac{{{\rm{ \mathsf{ π} }}{r^4} ＜ v ＞ {\rho _{_{\rm{l}}}}}}{{{w^2}}}g\left( {\frac{y}{w}} \right)$ | (2) |
| ${F_{{\rm{NW}}}} = 6C\frac{{{r^3}\eta {s_0}}}{\delta }$ | (3) |
式中，＜v＞是载液的平均速度，ρl是载液密度，y是颗粒中心到积聚壁的距离，w是分离通道的厚度；C是经验无量纲系数，δ是颗粒下表面到积聚壁的距离，η是载液黏度，s0是积聚壁上的流体剪切速率。其中）可由下式给出[4]：
| $\begin{array}{l} g\left( {\frac{y}{w}} \right) = 19.85\left( {0.19 - \frac{y}{w}} \right)\left( {0.15 - \frac{y}{w}} \right)\left( {0.81 - \frac{y}{w}} \right)\\ \quad \quad \quad \quad \left[ {1 + \frac{{16}}{{25}}\frac{y}{w}\left( {1 - \frac{y}{w}} \right)} \right] \end{array}$ | (4) |
结合式（2）、（3）、（4）可知，HLF与载液平均速度、密度、黏度、通道厚度、颗粒尺寸及颗粒在通道中所处的位置有关。
假设惯性升力可以被忽略，那么作用在颗粒上的净作用力Fnet可表示为[10]：
| ${F_{{\rm{net}}}} = 6C\frac{{{r^3}\eta {s_0}}}{\delta } - {F_{\rm{G}}}{\rm{cos}}\theta $ | (5) |
其中θ为通道纵轴与水平面之间的角度。当Fnet等于0时，颗粒处于平衡位置，此时颗粒下表面与积聚壁之间的距离为：
| $\delta eq = \frac{9}{2}\frac{{C ＜ v ＞ \eta }}{{{\rm{ \mathsf{ π} }}wl\rho \,{\rm{cos}}\,\theta }}$ | (6) |
由上式可看出，颗粒在通道内的平衡位置与颗粒大小无关。带负电的颗粒与带负电的积聚壁间存在的静电斥力也会影响颗粒的平衡位置[11]。因此，不同载液中颗粒保留行为的差异亦可通过HLF与静电力的共同作用来解释[12]。
载液在通道内的流速剖面为抛物线形，其流速v（x）可以用下式表示[10]：
| $v\left( x \right) = 6 ＜ v ＞ \frac{y}{w}\left( {1 - \frac{y}{w}} \right)$ | (7) |
颗粒在GrFFF中的保留可以用保留比（retention ratio，R）表示，R相当于颗粒迁移速度与载液平均流体速度，实验中可用通道死时间t0与样品保留时间tR的比值来计算[10]。在布朗洗提模式中，R可用下式表示[4]：
| $R = 6\frac{{KT}}{{FGw}}$ | (8) |
式中，K是Boltzmann常数，T是绝对温度。由式（8）可看出，在标准洗提模式下，R与载液流速无关，且可通过以下几种方法改变：改变通道纵轴与水平面的夹角，改变载液密度及改变通道厚度。由于缺少载液流动产生的HLF，样品的积聚作用较弱，导致峰变宽从而使得分离效果较差。故GrFFF多用于分离粒径大于1 μm的样品。
在空间洗提模式中，R可用下式表示[4]：
| $R = 6\frac{r}{w}$ | (9) |
由上式可知，R仅与颗粒尺寸及通道厚度有关，与载液流速无关。但随着流速增加，颗粒受到的HLF，当HLF增加到一定程度时，可将颗粒推离积聚壁，此时空间洗提模式将转变为聚焦洗提模式。聚焦洗提模式下的R可通过下式计算[4]：
| $R = 6\frac{y}{w}$ | (10) |
式中，y为颗粒中心到积聚壁的距离。
实际分离过程中，单纯的空间或聚焦洗提模式很少出现，多是空间与聚焦混合洗提模式，即空间/聚焦洗提模式。此时的R可用下式表示[10]：
| $R = 6\gamma \frac{r}{w}$ | (11) |
式中，γ是无量纲系数，它考虑了当颗粒接近积聚壁时，处于颗粒中心的载液阻碍颗粒迁移的升力和水动力效应。在空间洗提模式下，颗粒紧贴积聚壁沿通道纵轴移动，其迁移速度约等于距积聚壁一个颗粒半径的载液流速，因此γ值接近1。由于上面提及的流体动力效应，γ值也可能会小于1。在聚焦洗提模式下，颗粒在距积聚壁较远处移动，故γ值大于1，且γ值也可用来测量颗粒与通道壁之间的距离，比如γ值等于2说明颗粒距通道壁的距离约为2个颗粒半径。γ值会随实验条件改变而变化，如流速、通道厚度、颗粒尺寸等[3, 13-14]。
由于γ值受实验条件影响，因此在用GrFFF测定粒径时，需先使用一系列已知尺寸和密度的颗粒作为标准品，以log tR对log d作图，绘制标准曲线，其中为颗粒保留时间，d为颗粒直径。该曲线在10倍的颗粒直径范围内呈良好的线性。标准曲线斜率的绝对值可定义为基于粒径的选择性Sd，如下式所示[15-16]：
| ${S_{\rm{d}}} = \frac{{d\log {t_{\rm{R}}}}}{{d\log d}}$ | (12) |
分离度Rs是衡量不同样品组分间分离情况的参数，可用下式计算[4]：
| $Rs = 2\frac{{{t_{{\rm{R}}2}} - {t_{{\rm{R}}1}}}}{{{w_1} + {w_2}}}$ | (13) |
上式中，tR1、tR2分别是两峰的保留时间，w1、w2分别是两峰的峰宽。在FFF中，一般认为Rs=1时两组份完全分离。
塔板高度H是衡量峰增宽程度的参数，通常由几种影响因素组成，包括非平衡效应Hn、仪器效应Hi、多分散性效应Hp和扩散效应Hd。故H可表示为[4]：
| $H = {H_n} + {H_{\rm{i}}} + {H_{\rm{p}}} + {H_{\rm{d}}}$ | (14) |
在空间和聚焦洗提模式下，可假设不同大小颗粒的Hn和Hi是相似的。倘若所有样品颗粒的多分散性（Hp）相同，那么峰增宽主要是由扩散效应Hd引起的。随颗粒粒径减小，扩散效应增加，因此H将随颗粒粒径减小而增加[17]。
实验中，H可通过下式计算[17]：
| $H = L/N$ | (15) |
上式中L是通道长度，N是理论塔板数。N也可通过保留时间tR和半峰宽w1/2测得：
| ${\rm{N}} = 5.54{\left( {{t_{\rm{R}}}/{w_{1/2}}} \right)^2}$ | (16) |
在国内，张学军等[18]利用GrFFF分离小麦粉，同时结合图像处理测量小麦粉粒径，结果发现分离后的小麦粉样品被分成了粒径相近的几部分。这种表征颗粒大小的方法简单直观，为其余微米级粉粒尺寸的测量提供了一种全新的方法。此外，其讨论了GrFFF在中药分离中的可行性，并用GrFFF分离了牛黄清肺散，结果表明GrFFF可根据牛黄清肺散样品中各组分的尺寸及密度差异完成分离。因分离在室温下进行，且未加入任何化学试剂，故GrFFF不会破坏中药中的有效成分，且简单易行，这为分离、提纯中药提供了一种新的方法[19]。随后，他们又利用重力热耦合场流分离技术分离牛黄清肺散，结果发现该技术可很好地分离牛黄清肺散中的各成分，且分析时间比单一GrFFF短[20]。蒋东霖等[21]依据GrFFF理论，结合微流道设计和优化，自行组装了GrFFF系统，成功地分离了聚氯乙烯（PVC）颗粒。并将实验结果与理论计算结果进行对比，为重力场流分离的后续研究提供参考。
国外GrFFF主要应用在分离分析硅胶颗粒、PS颗粒、淀粉颗粒、胶体混悬液等方面。
2.1.1 硅胶颗粒早期硅胶颗粒常被用作模型分析物研究通道或载液等条件对分离效果的影响。Pazourek Jiri[22]等研究了样品前处理、进样量、停流时间对分离的影响，提出进样量过大会造成过载效应，随后其[23]优化了流速、离子强度，通过加入氯化钠来增加离子强度，结果发现离子强度可通过影响静电斥力来影响颗粒的保留。Pierluigi Reschiglian等[24]研究了载液组成对硅胶颗粒保留的影响，指出表面活性剂的作用是抑制样品在通道壁上的吸附，并首次提出了势垒重力场流分离模式（PBGrFFF），这种模式下，颗粒与通道壁间的吸附作用是可逆的。Plockova等[12, 25-27]提出了一系列不同分离模式下进行场编程的方法，如在聚焦洗提模式下优化流速，研究了恒定流速、线性梯度、多线性梯度、抛物线梯度和不连续梯度流速对分离的影响，同时通过使用变截面通道来改变流速，结果发现流速梯度的优化效果比变截面通道的好；在布朗和聚焦洗提模式下优化载液密度；通过向载液中加入HPMC来研究黏度的影响。这些都是通过影响作用于硅胶颗粒上的合力场来影响分离结果的。其中，密度对保留的影响如图 3所示。
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V0.死体积峰（peak corresponding to void volume）1. 10 μm 2. 5 μm 3. 1.6 μm 图 3 模型硅胶混合物在17%（A）和76%（B）甲醇中的分离图 Figure 3 The fractograms of the model silica mixture obtained in 17% methanol(A)and in 76% methanol(B)[27] |
Pierluigi Reschiglian等[28]利用GrFFF测定硅胶颗粒的粒度分布曲线，并与激光粒度分析仪所得结果进行对比，结果表明GrFFF适用于表征颗粒的粒度分布；之后，其建立了GrFFF定量测定硅胶颗粒粒度分布的无标样法[29]。
2.1.2 聚苯乙烯颗粒聚苯乙烯（PS）颗粒也常作为模型分析物来优化GrFFF分离条件。Park等[3]以PS为样品研究了通道纵轴与重力场之间的角度、通道厚度和流速对洗脱参数（保留时间、选择性、峰宽和分离度）的影响。Lee等[10]研究了载液黏度、通道角度对PS颗粒的保留时间、分离度和塔板高度的影响。Woo等[30]研究了载液离子强度、黏度、流速对保留时间和分离度的影响。郭爽等[7]以PS微粒作为模型样品，利用自组装加工的GrFFF仪器，研究了载液中离子强度、混合表面活性（SDS和吐温80）的比例、流速对保留比和塔板高度的影响；之后，其[31]运用正交设计试验研究了载液的离子强度、黏度、甲醇浓度和流速对保留的综合影响，结果表明黏度对GrFFF中微粒的分离度有显著影响。
此外，Park等[32]利用GrFFF研究乳液聚合过程中的不同反应参数对合成的PS乳胶微球粒度分布的影响，将实验结果与光子相关光谱法（PCS）和光学显微镜（OM）所得结果相比较，发现GrFFF分析时间比OM短，数据比PCS准确，特别是对于具有宽粒度分布的颗粒来说。结果表明GrFFF是表征PS乳胶微球粒度分布的有用工具。
2.1.3 淀粉颗粒淀粉颗粒的粒径在1~55 μm，大麦、小麦、黑麦中的淀粉呈现典型的双峰粒度分布，其他品种的淀粉颗粒（如大米、玉米）是单峰粒度分布[33]。呈双峰粒度分布的淀粉含2种颗粒：粒径为10~40 μm的椭圆形大淀粉颗粒，称为A；粒径为1~10 μm的球形小淀粉颗粒，称为B。淀粉中A和B颗粒的数量比会影响其特性，如麦芽品质，故对淀粉颗粒的粒度分布进行评估是有重要意义的[34]。GrFFF因操作简单、成本低、分析时间短和条件温和等特点，可广泛用于淀粉颗粒的粒度表征。
Janousková等[35]利用GrFFF分离大麦淀粉颗粒，以洗脱时间和分离度为指标，优化了样品前处理、流速、进样量等实验条件，流速对分离的影响见图 4，结果表明实验前淀粉颗粒浸泡至少24 h，流速0.8-1.0 mL·min-1时可提供最短的分离时间和最佳的分离度。
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1.淀粉A颗粒（starch A granules）2.淀粉B颗粒（starch B granules） a. 2.0 mL·min-1 b. 1.5 mL·min-1 c. 1.0 mL·min-1 d. 0.8 mL·min-1 e. 0.5 mL·min-1 图 4 不同恒定流速对淀粉颗粒分离的影响[35] Figure 4 The influence of different constant flow-rates on the separation of starch granules |
Chmelik等[36]利用GrFFF表征大麦淀粉颗粒的粒度分布，实验结果与扫描电镜（SEM）、小角激光光散射（LALLS）和光学显微镜数据图像分析（IAOM）所得结果相比较，无显著性差异。Psota等[37]利用GrFFF与LALLS评价其中春大麦胚乳中的淀粉颗粒含量，两者的结果间存在明显的相关性；之后，他们通过GrFFF和LALLS研究大麦淀粉颗粒的尺寸分布，从而研究麦芽参数与大/小淀粉颗粒比的关系[38]。Chmelik等[39]也利用GrFFF分离测定大麦淀粉中的大/小淀粉颗粒比，从而研究其与大麦品种的麦芽质量的关系。
Contado等[33]将SPLITT技术与GrFFF联用，对小麦淀粉颗粒进行分离表征，用光学显微镜收集分离组分以验证分离结果。最终证实了GrFFF可有效分离小麦淀粉颗粒，且能保证分离过程中淀粉颗粒的稳定性。
Mazanec等[34]使用GrFFF检测大麦淀粉颗粒的水解过程，研究水解前后淀粉颗粒的尺寸及双峰分布的变化（如图 5所示），同时利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定酶消化过程中的游离糖释放。GrFFF的结果与之前的研究结果及酶催化反应相吻合，且不需要复杂的流动相或样品前处理，设备稳定可靠，分析时间短，基于这些特点，GrFFF是一种监测淀粉颗粒粒度分布变化的简单经济的方法。
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图 5 GrFFF监测大麦淀粉水解[34] Figure 5 GrFFF monitoring of barley starch enzymatic hydrolysis |
Ahanasopoulou等[40]利用基于改变载液pH来改变表面势能的PBGrFFF分离表征多分散的CuZnS胶体混悬液，所得结果与传统GrFFF及激光计数法相比较，表明PBGrFFF不仅能用于分离表征胶体混悬液，也能用于研究胶体与固体表面的相互作用；之后，其[41]利用GrFFF分离表征多种CuxZ（1-x）S胶体混悬液的粒度分布，通过数量平均粒径和重量平均粒径随溶液pH、离子强度、去污剂的种类和时间的变化，加上微电泳测量，推导出硫化物胶体的稳定性及聚集、沉积现象。并且用激光粒度测量法验证了该方法的可靠性。
Rasouli等[42]应用GrFFF的布朗洗提模式依据形状和尺寸分离了2种密度相同的TiO2胶体混悬液，实验结果与SdFFFF相比较，发现GrFFF的分离精度更高。
2.1.5 基于尺寸的元素形态分析GrFFF还可用于基于尺寸的元素形态分析，通常与其他分析技术联用得到元素含量与尺寸分布的关系。Chantiwas等[43]利用GrFFF分离针铁矿涂覆的、直径5和10 μm的二氧化硅颗粒，应用UV监测洗提时间，配合使用化学发光法（CL）和电热原子吸收光谱法（ETAAS）测量不同时间铁元素的含量，从而得到铁元素生成和颗粒尺寸的关系。他们又将GrFFF与ETAAS联用，分离测量粒径范围5~20 μm的3种富铁黏土颗粒中的铁含量，比较两者的联用方式（离线/在线）对分离效果的影响，结果表明收集GrFFF的分离组分后再注入ETAAS仪具有更好的分离效能[44]。将基于铁质量的粒度分布和铁浓度对粒径作图，得到基于颗粒尺寸的铁形态分析。
2.1.6 其他GrFFF还可用于石墨粉、花粉等微粒的分离表征。Rasouli等[45]利用GrFFF表征和纯化石墨粉，所得结果与激光粒度分析仪比较，最终区别出2种亚群。说明结合GrFFF与激光粒度分析仪可用于研究粉碎过程中多分散性粉末颗粒的大小和形状。Kang等[46]利用GrFFF和SdFFFF对树和百慕大草的花粉进行分离及尺寸表征，并用光学显微镜验证分离结果，发现GrFFF与SdFFFF的结果无显著性差异，且与光学显微镜所测值相符。说明GrFFF可快速对花粉及其他微米级的环境来源颗粒进行尺寸表征。Reschigliani等[47]利用GrFFF对环境相关的超微米颗粒的水分散液进行尺寸表征和定量分析。
2.2 生物分子的分离 2.2.1 红细胞早期GrFFF常用于人血样中红细胞的分离分析。Cardot等[48]利用GrFFF从外周血细胞中分离红细胞，作为生物医学的辅助诊断。Merino-Dugay等[49]联用GrFFF、显微镜观察和粒度分析研究苯肼诱导的贫血兔子血样中红细胞群的组成变化并纯化不同贫血阶段的细胞亚群，以助于监测这一病理学。Urbánková等[50]利用GrFFF分离红细胞，研究了流速、进样量、血液浓度和松弛时间对保留比的影响。Rasouli等[51]研究了GrFFF中通道尺寸对红细胞保留的影响。Plocek等[52]发现利用GrFFF分离血样时，用不带电、不吸附的亲水材料修饰通道壁可显著降低样品与通道壁间的相互作用及吸附效应。Cardot等[53]利用GrFFF分离正常和病理红细胞，发现密度未知的情况下正常红细胞的保留与尺寸间无直接关系，病理红细胞的保留机制与密度及形状有关。说明GrFFF可用于研究细胞的生物物理学特性，作为生物医学的辅助诊断。Bernard等[54]发现GrFFF可分离不同尺寸、密度和刚性的红细胞。Parsons等[55]利用SdFFFF与GrFFF分析健康人及镰状细胞贫血患者血样中的红细胞，测定分离图与传统血液学参数间的关系。结果表明SdFFFF与GrFFF得到相似的红细胞谱图，且FFF参数与血液学指数间的关系也是一致的。Cardot等[56]利用GrFFF分离血样中的红细胞，收集分离组分并测定细胞内与细胞年龄相关的酶的活性。结果成功分离有核细胞、网织红细胞与红细胞，且表明红细胞是根据年龄来分离的。最终结果表明颗粒的形状、刚度，加上尺寸和密度，是控制生物微粒在GrFFF中保留的关键生物物理因素。Melucci等[57]联用GrFFF和CL分离检测全血中的红细胞，研究了不同的联用方式，发现采用柱后流动注射分析的在线联用方式可获得最佳的分析效果，且检测限比全血中红细胞的浓度低5个数量级。
2.2.2 干细胞同质细胞群体的分离日趋重要，因为分选出的细胞在细胞治疗、基因分析和蛋白质组学方面有着广泛的应用。目前常用的细胞分选方法都需使用免疫标记物，如荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选法（MACS）等。干细胞是能保持组织结构和功能完整性的“原始”细胞，如果采用FACS或MACS分离干细胞，那么形成的抗原-抗体免疫复合物会干扰干细胞的分化并改变其生理特性。因此不需要免疫标记物的、分离过程中能保持细胞活性的GrFFF技术逐渐引起科学家的注意。且由于仪器、操作和人员培训的成本低，GrFFF很适合与流式细胞术（FC）、菌落形成单位检测（CFU）等细胞表征技术联用[58]。
Urbánková等[59]从小鼠骨髓细胞悬液中分离造血干细胞，使用库尔特计数仪表征分离组分并用于辐射小鼠的移植。Roda等[58]利用GrFFF从外周血单采的细胞样品中分离造血干祖细胞（HSPCs），FC和CFU表征分离组分的活性及多分化潜能。结果证明了GrFFF分选造血干细胞具有高选择性，且能保证其活性和分化潜能。
Barbara Roda等[60]还利用GrFFF从临床样本中分选、纯化间充质干细胞，区分不同来源及具有不同分化潜能的间充质干细胞，用FC评估分离效果，并评价分离组分的分化潜能。结果表明，GrFFF可很好地分离间充质干细胞（MSCs）和上皮细胞（AECs），且分离后的细胞具有更高的分化率。该法具有经济、易于放大、生物相容性好的优点，可用于临床有效地分选干细胞。Radtke等[61]利用GrFFF筛选马肌肉组织、骨膜组织、骨髓和脂肪组织的间充质干细胞亚群，每种细胞均分成6个活性组分，分别合并收集的组分用于进一步测定，结果表明分离的组分具有活性，可用于马干细胞应用和兽医学；之后，其又筛选肌肉组织和骨髓的间充质干细胞亚群，并配合使用FC、组织化学、骨结节化验、实时qPCR技术比较其成骨能力[62]。结果显示不同的间充质干细胞亚群具有不同的成骨能力，为兽医学中使用马干细胞疗法诱导骨愈合提供重要的参考价值。
2.2.3 酵母细胞近年来活性干酵母常作为酿酒的发酵剂，其活性是一个与终产品质量密切相关的重要的质控参数，因此需建立筛选并表征酵母细胞的方法。在分析化学领域，常使用分离方法来协助质量评价，这些方法可提供分析物的“指纹图谱”，或是降低样品的复杂性以便应用不相关且更特异的技术进行进一步表征[63]。GrFFF就是这样一种温和的分离技术，且可与不同的检测技术联用来表征酵母细胞，如UV、荧光检测、光散射、FC和库尔特计数等。GrFFF和SdFFFF被用于测定超声处理对酵母细胞分离效果的影响，结果表明进样前超声2 min能获得最佳的酵母细胞悬浮液，实现最好的分离结果[64]。Sanz等[65]先利用PS颗粒优化分离条件，在最佳条件下应用GrFFF分离活性干酵母，配合使用SEM、库尔特计数器监测其分离程度及描述酵母细胞群分布的能力；后来他们发现GrFFF主要基于酵母细胞除粒径外的其他物理特性差异，如形态、密度、表面特性等分离酵母细胞[63]。联用GrFFF与FC表征几种活性干酵母的活性，评估其用于葡萄酒发酵的质量，从而筛选出好的酵母细胞用于发酵[66]。GrFFF亦可与荧光检测器联用测定商业酿酒酵母细胞的活性，发现GrFFF能有效替代FC和库尔特计数提供准确的细胞活性测定，且更简单、经济[67-69]。Farmakis等[70]应用GrFFF研究酵母细胞在小麦淀粉颗粒为酶解时的生长率，说明小麦淀粉颗粒是酵母菌迅速生长的自然媒介。Lainioti等[71-73]致力于研究发酵过程中酵母细胞的增殖，将GrFFF与反流式气相色谱法（RFGC）和HPLC联用，监测酵母细胞增殖，区分生长阶段并研究发酵动力学；此外，还分别在有/无小麦淀粉颗粒作为固定化载体的情况下优化了发酵温度。Kim等[74]利用GrFFF和GC监测酿酒酵母细胞核醋酸杆菌的混合发酵过程，比较了静置和摇床2种模式下，细胞数目及乙醇、乙酸产量的变化。
2.2.4 其他细胞GrFFF还可用于其他细胞的分离，并与FC、CFU等联用，对分离的细胞组分进行表征。Barbara Roda等[75]利用GrFFF分离正常淋巴细胞和Raji淋巴瘤细胞，收集分离组分用FC和CFU进行免疫、形态和功能表征，分离图如图 6所示。Lattuada等[76]利用GrFFF直接从原始脐带样本中分离人脐静脉内皮细胞（HUVEC），UV监测洗脱过程，FC验证分离后的富集水平和细胞活性，并从分离出的HUVEC中提取RNA用于进一步分析。Aldo Roda等[77]用GrFFF筛选均匀的且处于最佳生长周期的生物发光细胞，筛选的生物发光细胞用于测定污水处理厂的废水和自来水中的铜含量，并与火焰原子吸收法（FAAS）比较。表明GrFFF不仅能用于分离表征细胞，也能分选出最适合用于生物传感的细胞。
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图 6 正常和Raji淋巴细胞混合物（80:20）的GrFFF分离图 Figure 6 GrFFF fractogram of a 80:20 mixture of normal and Raji lymphocytes[75] |
在分离细菌方面，GrFFF也有着广泛的应用。Reschiglian等[78]利用重力场流和非对称流场流分离（AF4）技术依据菌毛来分离、定量失活的大肠杆菌，以对细菌疫苗进行质量控制，同时应用SEM、动态光散射（DLS）等不相关的技术分析大肠杆菌的尺寸和形态。Magliulo等[79]联用GrFFF和CL检测生物样品中的小肠结肠炎耶尔森菌，所得结果与传统的微生物方法进行对比，发现完全一致。结果表明GrFFF是一种成本低、分析时间短、易于自动化的检测细菌技术。Jung等[80]利用GrFFF、光学显微镜和细胞计数来研究不同培养时间金黄色葡萄球菌的形态变化，以监测金黄色葡萄球菌的集群行为。结果表明GrFFF可有效监测细菌的集群行为，且具有条件温和、设备简单、分析时间短的优点。若将GrFFF与尺寸敏感的检测器（如光散射检测器）在线联用，可提供更多关于金黄色葡萄球菌集群行为的信息，如菌群的绝对尺寸和密度。Barbara Roda等[81]利用GrFFF分离金黄色葡萄球菌，研究通道表面组成与生物样品黏附的关系，结果发现先用BSA处理通道壁随后使用离子束溅射（IBS）技术在通道表面涂布一层含氟聚合物膜。可显著提高分离性能；之后，他们利用GrFFF结合抗原-抗体特异性反应来分离小肠结肠炎耶尔森菌和大肠杆菌[82]；此外，他们还首次提出联用GrFFF与金属氧化物半导体（MOS）区分同种细菌的活细胞和死细胞，同时使用这一集成系统检测人工污染的牛奶中同时存在的两种细菌—大肠杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌，预测值均100%正确。建立的GrFFF-MOS集成系统被认为是一种简单的可直接从食物基质中识别病原菌的方法[83]。
2.2.6 酶在酶的分离检测方面，GrFFF常与化学发光（CL）技术联用，从而实现对酶的定量测定。Melucci等[84]联用GrFFF与CL技术分离定量游离/结合在PS微球上的HRP，说明该技术能快速测出混合样品中游离和被束缚的酶的质量比，可用于基于PS微球固定化的抗体的免疫测定，如竞争性免疫测定。Casolari等[85]在线联用GrFFF和CL检测健康人和胆汁阻塞患者血浆中的碱性磷酸酶（ALP）活性，该法样品盒试剂消耗少、分析时间短、重复性高，线性范围50~1 400 IU· L-1。该集成的POCT（床边检测）系统易应用于从全血中在线制备血浆用于其他临床生物标记物测定或其他测定方法，如免疫测定和DNA杂交。
2.2.7 寄生虫GrFFF还可用于寄生虫等生物样品的分离检测，实现其在药理学方面的应用。如Merino等[86]利用GrFFF分离丝虫感染患者血样中的微丝蚴和红细胞，显微镜验证分离结果，结果得到高的微丝蚴回收率，这说明GrFFF可实现微丝蚴的制备型分离，实现了GrFFF在药理学研究方面的突破。Bories等[87]利用GrFFF检测卡氏肺孢子虫包囊，研究其在不同实验条件下的洗脱，发现可通过修饰通道壁或载液改变样品保留。说明GrFFF可用于建立新的诊断方法，样品-壁相互作用及其改变可用于寻找新的支气管肺泡灌洗液。Bernard等[88]应用GrFFF选择性地分离纯化阴道毛滴虫的活细胞和死细胞，分离组分在培养基中纯化，活的滋养体的回收率高达85%。
2.3 与其他场流技术联用GrFFF与其他FFF技术联用，可更精确地表征样品的粒度分布，并获得生物物理学的多维信息。如离线联用GrFFF和流场流分离（FFFF）可说明细胞密度差异是GrFFF分离酵母细胞的主要机制，获得更精确的粒度分布及酵母细胞间的密度差异信息，这些都是与酵母细胞的生长阶段密切相关的[89]。联用重力SPLITT分离技术（GSF）和SdFFFF分离海底沉积物样品并对收集组分进行表征，可得到更精确的粒度表征信息。结果表明两者的联用可有效分析复杂且多分散性的颗粒样品，如海底沉积物[90]。Kim等[91]利用GSF将焚烧飞灰预分离成6个组分，收集组分应用SdFFFF和ICP-MS进行分析，电子显微镜验证SdFFFF分离结果。结果表明焚烧飞灰有几纳米到50 μm的宽粒度分布，含钙、锶、镁、铁和钯等大量的无机元素，痕量元素浓度与粒径间无相关性。
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表 1 GrFFF的应用现状 Table 1 Application situation of gravitational field-flow fractionation |
紫外可见分光光度法（UV-Vis）是GrFFF最基本的一种检测方法，可检测在紫外和可见光区有吸收的物质，上述提到的样品均可用该方法检测，能获得样品的出峰时间等基本信息，监测洗脱过程。然而通用性及灵敏度均不及CL等检测方法[84]，且不能获得样品的粒度分布、形状、数量等方面的信息，故多用于基础研究，或是与其他检测方法联用以获得更多的样品信息。
荧光检测器在使用荧光探针作为活性生物标记物的基础上，能直接测定细胞结构、功能特性并区分不同生理特性的细胞。将其可与GrFFF联用能有效测定酵母细胞的活性，具有良好的线性、重复性及低的检测限，可替代昂贵的流式细胞术和库尔特计数器[67-69]。
与传统的紫外-可见分光光度法和荧光检测相比，CL法具有更高的检测能力和灵敏度，应用范围广泛，特别是在生物分析化学方面[84, 92-93]。联用GrFFF和CL可分离检测全血中的红细胞[57]、ALP[85]，细菌[79]、游离/结合在PS微球上的HRP[84]等，同时可测定针铁矿涂覆的SiO2颗粒中的铁含量[43]。
OM、SEM用于表征GrFFF分离组分的形状及尺寸，验证GrFFF的分离效果，通常是离线收集分离组分进行测定，在小麦粉[18]、中药牛黄清肺散[19-20]、PVC颗粒[21]、PS颗粒[32]、淀粉颗粒[36-37]、TiO2胶体混悬液[42]、花粉[46]、MSCs[61-62]、细菌[78, 80]、寄生虫[86]、酵母细胞[89]等尺寸表征中均有应用。
表征样品粒度分布的检测方法还有PCS、激光粒度分析仪、LALLS、DLS、库尔特计数器等。光子相关光谱法可用于表征PS乳胶微球的粒度分布，所得结果与GrFFF结果相比较，表明GrFFF可准确表征宽粒径分布的颗粒[32]。激光粒度分析仪可用于测定硅胶颗粒[28]、淀粉颗粒[34]、多分散的胶体混悬液[41]、石墨粉[45]等的粒度分布，所得结果与GrFFF的结果进行对比，验证GrFFF区分颗粒亚群、表征颗粒粒度分布的能力。LALLS主要与GrFFF结合用于表征大麦淀粉颗粒的粒度分布，测定A/B颗粒的比例，从而研究其与大麦品种麦芽质量的关系[36-38]。DLS已用于表征GrFFF分离后的大肠杆菌的粒径[78]。库尔特计数器可用于细胞、颗粒的计数及粒度分析，且测得的粒径比激光衍射、光散射法的结果准确。其常与GrFFF离线联用，测定GrFFF分离的细胞组分的粒径及数目，以验证方法的有效性，可用于造血干细胞[59]、酵母细胞[63, 65, 67-69]、金黄色葡萄球菌[73]等。
利用GrFFF分离细胞时，常应用FC、CFU等对分离组分进行免疫、形态和功能表征，以验证分离效果，如用于干细胞[58, 60, 62]、淋巴细胞[75]和HUVEC[76]等的分离表征。
此外，还有MALDI-TOF MS、ETAAS、RID等检测方法。MALDI-TOF MS可测定酶水解过程中释放的低聚糖，与GrFFF联用能监测大麦淀粉颗粒的水解过程[34]。离线联用ETAAS和GrFFF能分离测定不同尺寸颗粒中的铁元素含量，从而得到基于颗粒尺寸的铁形态分析[43-44]。还可将GrFFF与RID联用，用于蔗糖等多糖的分离检测[71, 73]。
3 总结与展望作为最简单的一种场流分离技术，重力场流分离有着广泛的应用，可分离粒径几微米到几百微米的颗粒，如硅胶颗粒、PS颗粒、淀粉颗粒、胶体混悬液、石墨粉、花粉及环境相关微粒等，具有操作简单、分析时间短、成本低等优点。GrFFF可与SEM、MS、ETAAS、CL、激光粒度仪、光散射等多种分析技术联用，表征样品的粒度、形状、密度等多种生物物理特性。因其分离条件的温和性还可用于细胞、细菌、酶等生物样品的分离，能在分离过程中保持样品活性和功能的完整性，故分离后的生物样品可用于进一步的培养或直接使用。
然而，目前重力场流分离仪器并没有大规模商业化，国外大多数研究人员仍采用自组装加工的仪器进行研究，国内对于GrFFF方面的研究也相对较少；此外重力场相对较弱且不易控制，故GrFFF技术的发展不如LC或CE成熟，应用范围也不及FFFF广泛。但GrFFF在生物样品分析方面确实显示出了巨大的潜力。相信随着研究的深入，在不久的将来，GrFFF作为一种无标记的细胞分选技术将在生物和医学领域发挥更大的作用，比如制备特异性的干细胞用于再生医学。此外，鉴于GrFFF可直接从全血样品中在线制备血浆而不需经过离心步骤，可考虑将其与CL等技术联用，用于疾病标记物的检测、免疫分析和基因探针检测等方面。微型化也是未来的一个发展趋势，可通过微通道的设计将GrFFF系统进一步微型化，从而整合到床边检测（POCT）系统中，以期能替代传统的临床检测设备。
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