2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
重组人促红素（recombinant humanerythropoietin，rhEPO）是一种应用基因工程技术，将人EPO基因转入哺乳动物细胞内，高效表达的糖蛋白。其相对分子质量为18 235 Da（含165氨基酸）；糖基化程度高，具有3个N糖位点、1个O糖位点，糖链末端唾液酸化程度高，糖型较为复杂。促红素能有效增加人体血液中红细胞数量，提高血液含氧量，维持和促进正常的红细胞代谢, 主要治疗肾功能不全所致贫血，包括慢性肾功能衰竭行血液透析、腹膜透析治疗及非透析病人[1-3]。促红素是目前治疗肾性贫血最有效的药物，随着市场需求量不断扩大，必须严格控制药品质量。
完善的质量标准是药品安全有效的重要保障，在药品质控标准中经常要用到对照品。对照品是确定药品真伪优劣的对照，是控制药品质量必不可少的工具。如何对理化对照品进行质量评价是首要解决的问题，本文按照中国药典2015年版三部中人用重组DNA蛋白制品质量控制总论指导原则，从重组人促红素原液的质控标准为基础，结合理化对照品的特殊性，拟定了重组人促红素理化对照品评价项目。本次评价所用样品，来自8家国内外企业。文中以A~H为这8家企业样品编号。本文就理化对照品的理化特性，糖基化修饰，异构体比例含量等进行了分析比较，并按照质量标准对8家企业的理化对照品进行质量评价。
1 材料和方法 1.1 仪器及设备PPSQ-21A蛋白质N末端序列分析仪（岛津公司）；UV-1601PC紫外-可见光分光光度计（Beckman公司）；Mini-protein3电泳仪（GE公司）；Spectra MAX250酶标仪（MD公司）；离心机（Beckman公司）；Waters Alliance 2695高效液相色谱系统（Waters公司）；Waters 2996二极管阵列检测器（Waters公司）；Waters ACQUITY H-Class超高效液相色谱系统（Waters公司）；Symmetry 300 C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Waters公司）；BEH300 C4色谱柱（2.1 mm×50 mm，3.5 mm；填料：丁烷基硅烷键合硅胶；Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH Glycan色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm；填料：亚乙基桥杂化颗粒；Waters公司）；PA800 plus毛细管电泳仪（Beckman公司）；Xevo G2 QTof质谱仪（Waters公司）；Masslynx4.2操作软件（Waters公司）；Biopharmalynx数据处理软件（Waters公司）；32 Karat™系列软件（Beckman公司）。
1.2 试验试剂Trypsin试剂盒（Calbiochem公司）；糖苷酶PNGase F（NewEngland公司）；透析膜（Milli-Q）；试验用水为Milli-Q超纯水，乙腈为色谱纯，甲酸、碳酸氢铵、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAM）均为分析纯。A~H号样品为8批EPO理化对照品，分别来自哈药集团有限公司、华北制药股份有限公司、成都地奥集团、山东昂德生物药业有限公司、沈阳三生制药有限责任公司、山东科兴生物制品有限公司、上海凯茂生物医药有限公司及上海罗氏制药有限公司8家企业。
1.3 方法 1.3.1 相对分子质量测定通过超滤将样品溶剂置换为100 mmol·L-1的碳酸氢铵溶液，并调节蛋白浓度至约1 mg·mL-1，取20 μL加入糖苷酶2 μL，37℃孵育3 h。用Waters ACQUITY H-Class液相色谱仪及Xevo G2 QTof质谱仪进行测定。色谱条件：采用Waters BEH300 C4（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）色谱柱，流动相为水（A）-乙腈（B）-1%甲酸水溶液（C），梯度洗脱（0~4.5 min，85%B→5%B，10%C；4.5~5.5 min，5%B→85%B，10%C），流速0.4 mL·min-1柱温为80 ℃；样品保存温度为10 ℃；上样量1μL；质谱条件：MSE模式采集数据，毛细管电压3 000 V，Cone电压40 V，去溶剂气体温度350 ℃，源温120 ℃，去溶剂气体流速800 L·h-1，扫描范围m/z 500~4 000。
1.3.2 液质肽图绘制取0.4 mL样品加入超滤管中，10 000 r·min-1离心10 min，弃去滤过液，加入50 mmol·L-1的碳酸氢铵溶液0.4 mL，重复离心步骤；上述超滤步骤操作3次，测定超滤后样品的紫外吸收以计算其蛋白浓度，并用50 mmol·L-1的碳酸氢铵溶液将蛋白浓度调节至2 mg·mL-1，此为待用样。取待用样25 μL，加入V8蛋白酶（50 μg·mL-1）45 μL，37℃孵育过夜，加入糖苷酶2 μL，37℃孵育2 h，再加入0.1 mol·L-1的DTT溶液1 μL，37℃孵育1 h。用Waters ACQUITY H-Class液相色谱仪及Xevo G2 QTof质谱仪进行测定。色谱条件：采用BEH300 C4（2.1 mm×50 mm，3.5μm）色谱柱，流动相为水（A）-乙腈（B）-1%甲酸水溶液（C），梯度洗脱（0~60 min，1%B→60%B，10%C；60~61 min，60%B→90%B，10%C；61~75 min，90%B→1%B，10%C）；流速0.2 mL·min-1，柱温为40 ℃，样品保存温度为10 ℃，上样量5 μL；质谱条件：MSE模式采集数据，毛细管电压3 000 V，Cone电压40 V，去溶剂气体温度350 ℃，源温120 ℃，去溶剂气体流速800 L·h-1，扫描范围m/z 50~2 000。
1.3.3 二硫键分析取待用样25μL，加入V8蛋白酶（50 μg·mL-1）45 μL，37 ℃孵育过夜，加入糖苷酶2 μL，37℃孵育2 h备用。色谱条件与质谱条件同“1.3.2”项测定。
1.3.4 N寡糖分析用100 mmol·L-1的碳酸氢铵溶液调节待用样浓度至1 mg·mL-1，取20 μL，加入0.2 mL离心管中，再加入PNGase F酶2 μL混合后，置于金属浴中37℃酶切过夜（约17 h）；向0.2 mL离心管中加入3倍体积的冷乙醇（-20℃），混合均匀后于-20℃静置1 h，4℃，10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清，冻干备用。称取2-氨基苯甲酰胺（2-AB）5.5 mg，加入DMSO-冰醋酸混合物（取DMSO 350 μL，加入冰乙酸150 μL，混合均匀）100 μL，震荡至2-AB溶解；加入硼氢化钠100 μL，加入所有DMSO/醋酸/2-AB混合物中，充分震荡后，放入65℃金属浴中保温3 min，使硼氢化钠固体完全溶解，此为标记试剂。向冻干样品中加入标记试剂10 μL，置于金属浴中65℃反应共3 h。加入体积分数为80%的乙腈50 μL，混合均匀后，4℃，10 000 r·min-1离心10 min，即获得用于色谱分离的供试溶液。用Waters ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪及Waters XevoG2 QTof质谱仪检测。色谱条件：采用ACQUITY UPLC BEH Glycan（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色谱柱，以100 mmol·L-1甲酸铵为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱（0~35 min，65%B→50%B；35~45 min，50%B→65%B），流速0.4 mL·min-1，荧光检测（激发波长330 nm，发射波长420 nm），柱温（60±5）℃，进样2 μL；质谱条件：MSE模式采集数据，毛细管电压3 000 V，Cone电压40 V，去溶剂气体温度350 ℃，源温120 ℃，去溶剂气体流速800 L·h-1，扫描范围m/z 1 000~3 000。结合质谱及荧光检测结果，对各N-糖进行定性定量。
1.3.5 异构体分析准确称取氯化钠0.584 g，三羟甲基甘氨酸1.792 g，无水乙酸钠0.820 g，加入超纯水定容至100.0 mL，为电泳缓冲液储备液。准确称取尿素21.0 g，用25 mL超纯水溶解，加入电泳缓冲液储备液5.0 mL，加入1 mol·L-1腐胺溶液0.125 mL，混匀后用超纯水定容至50.0 mL，用乙酸调pH至5.55，为电泳缓冲液。0.1 mol·mL-1氢氧化钠为冲洗液。采用毛细管区带电泳法检测，毛细管电泳条件：进样压力3.45 kPa，进样时间10 s，分离电压15.4 kV，分离时间80 min，检测波长214 nm，样品池温度10 ℃，毛细管温度35 ℃。
1.3.6 其他项目检测蛋白质含量、体内比活性、电泳纯度、液相纯度、等电聚焦、唾液酸含量、N端氨基酸序列、肽图均按照中国药典2015年版三部相关要求检测完成。
2 结果 2.1 相对分子质量测定结果重组人促红素糖基化程度高，需去除N糖后测定相对分子质量，8批样品的相对分子质量均与理论一致。具体结果见表 1。O糖虽无法去除，但结构较为简单，不均一是由于O糖差异产生的，见图 1。不同企业的EPO制品存在不同类型的O-糖基修饰，根据质谱信号的丰度，可以得到8家企业生产的EPO理化对照品中不同类型O-糖基修饰所占比例，见表 2。
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表 1 8家企业的重组人促红素理化对照品相对分子质量（Mr）测定结果比较 Table 1 Comparison of relative molecular mass(Mr)results of physicochemical reference for recombinant human EPO from eight companies |
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图 1 A企业重组人促红素理化对照品质谱图谱 Figure 1 MSspectrometryof physicochemical reference for recombinant human EPO from company A |
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表 2 8家企业重组人促红素理化对照品O-糖基修饰所占比例汇总（%） Table 2 Ratio of different patterns of O-glycosylation of physicochemical reference for recombinant human EPO from eight companies |
重组人促红素糖基化位点较多，其末端唾液酸化程度高，寡糖类型繁多，通过糖苷酶切下N糖链后，2-AB做荧光标记，通过液质联用，综合8家企业样品绘制出N糖图谱，根据质谱相对分子质量分析寡糖组成进行糖型分析，并根据丰度对各个寡糖比例含量进行评价。N寡糖图谱也是一种重要的质量特征。8批样品中的N寡糖比例比较分析，统计结果见表 3。
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表 3 8家企业重组人促红素理化对照品N寡糖比例组成比较（%） Table 3 Comparison of N-linked oligosaccharide composition of physicochemical reference for rh EPO from eight companies |
重组人促红素是复杂的糖蛋白，糖链的差异决定其电荷异质性，等电聚焦结果为5~8条电荷异构体条带，这是重组人促红素的显著特征之一。采用优化的等电聚焦方法[4]对8批理化对照品分析结果见图 3。均符合规定。
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图 3 8家企业重组人促红素理化对照品等电聚焦图谱 Figure 3 IEF maps of physicochemical reference for recombinant human EPO from eight companies. |
重组人促红素是混合不同的异构体构成的，这种异构体的差异主要是由于寡糖链末端的唾液酸的比例不同造成的，而唾液酸对重组人促红素活性的影响尤其重要，采用毛细管区带电泳分析异构体可以对各个不同的异构体比例进行量化分析，结果表明8批样品的异构体组成是不同的，异构体毛细管电泳图谱是重组人促红素的又一显著质量特征。图 4是A、H样品的毛细管电泳图谱，由图可以看出，不同样品的电荷异构体的组成有较为明显的差别。8批样品异构体比例组成结果见表 4。
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图 2 rhEPO理化对照品部分肽段串联质谱解析图 Figure 2 Tandem mass spectra for parts of peptides of physicochemical reference for recombinant human EPO |
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图 4 A和H企业重组人促红素理化对照品的CZE电泳谱图 Figure 4 CZE maps of physicochemical referencen for recombinant human EPO from company A and H |
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表 4 8家企业重组人促红素理化对照品异构体比例结果（%） Table 4 Isoform proportions of physicochemical reference for recombinant human EPO from eight companies |
纯度测定分为电泳纯度（非还原SDS-PAGE法）及液相纯度（SEC-HPLC法）2种，按照2015年版中国药典三部方法检定，拟定的标准均不低于98.0%。8家企业的理化对照品纯度测定结果均符合规定，图 5为D样品纯度测定液相色谱图，具体结果见表 5。
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图 5 A企业重组人促红素理化对照品的HPLC色谱图 Figure 5 HPLC map of physicochemical reference for recombinant human EPO from company A |
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表 5 8家企业重组人促红素理化对照品部分项目检定结果 Table 5 Parts of test results of physical and chemical reference substances for recombinant human EPO from eight companies |
8批理化对照品的活性测定采用网织红细胞计数法，蛋白含量采用紫外消光系数法，所计算的比活性结果见表 5。其他项目如唾液酸含量，N端氨基酸序列均符合规定。部分检定项目结果见表 5。拟定的重组人促红素理化对照品质量标准见表 6。
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表 6 重组人促红素理化对照品质量标准 Table 6 Summary of quality specifications of physicochemical reference for recombinant human EPO |
理化对照品一级结构的确证是进行质量评价的基础。在拟定理化对照品的质量标准时，增加了结构确证的检测[5-6]，研究建立了一系列重组人促红素的质谱分析方法，如相对分子质量测定，液质肽图绘制，糖基化位点确证，二硫键链接方式确证[7-8]。研究表明，O-糖链对EPO的体内和体外活性均无明显的影响[9]，而N-糖链对活性影响非常重要，尤其是N寡糖链末端的唾液酸对维持结构稳定有重要作用[10-14]，本文针对寡糖结构和含量，增加了寡糖图谱的绘制，寡糖比例含量的测定；异构体的定量分析。
经检验，8家企业理化对照品一级结构得到确证，二硫键链接与理论一致。各企业的寡糖类型基本一致，但是在比例含量上差别明显。这种差别主要是糖基化水平不一致，跟宿主细胞，生理环境，发酵环境，生产工艺有关，形成每个企业特有的质量表征。这种糖基化的差异同样出现，在异构体检测中，8家企业对照品的异构体分布也有明显差别，形成特有质量表征。目前市场上称为α型和β型重组人促红素的氨基酸序列完全一致，区别主要是糖基化水平及异构体差异较为明显，其中β型的酸性异构体占比更多一些，在临床疗效上也有比较研究[12]。各异构体含量的变化是保证该药品质量稳定性和均一性的关键质控指标，注意到国内企业的对照品比活性较国外企业的总体略低，如何评价各异构体与含量和活性的关系需要进一步研究。本次理化对照品均为原液直接分装制得，稳定性还需进一步研究。
本次理化对照品来自国外企业的为β型，来自国内企业的尚未明确分型，但是通过毛细管区带电泳谱图可以比较容易找到两者差异，主要是各型异构体个数及比例分布。是否能作为分型的依据还需进一步确证。通过此次质量评价，国内外8家主要的重组人促红素生产企业的理化对照品均符合标准。国内企业的产品质量与国外企业相比较总体差距不大，但仍有提高的空间。
理化对照品的质量评价是产品质量控制的前提。中国药典2015年版三部也明确指出对理化对照品的质量评价要求，本文针对重组人促红素理化对照品，拟定了质量标准，期望能对其他理化对照品的质量评价提供有益的参考。
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