2017, Vol. 37 
2. 江苏德源药业股份有限公司, 连云港 222000
2. Jiangsu Deyuan Pharm. Co., Ltd., Lianyungang 222000, China
阿雷地平（aranidipine）为1，4-二氢吡啶类化合物，是从一系列不对称的4-芳基-1，4-二氢吡啶-2，6-二甲基-3，5-二羧酸化合物中筛选出的长效抗高血压钙拮抗剂。阿雷地平是具有24 h持续降压每日口服一次的钙拮抗剂，具有强力长效，降压作用。阿雷地平兼有L型和T型钙通道阻滞作用，还有开放钾通道的作用，具有生物利用度高，起效慢，作用持久等特点[1-5]。阿雷地平的二氢吡啶环上有1个不对称碳原子，存在S-型、R-型2个异构体，阿雷地平为外消旋体（图 1）。研究显示二氢吡啶类化合物对映体的体内活性差异较大，有的甚至成相反作用[6-8]；关于阿雷地平，有研究表明在Ca2+引起的离体兔动脉条收缩试验中，S-型阿雷地平阻滞Ca2+流入的活性比R-型大约高150倍，S-型和R-型之间并无相互作用。在清醒自发性高血压大鼠中，S-型的降血压作用是阿雷地平（消旋体）2倍，而R-型无作用，阿雷地平的药理活性主要是来自于S-型异构体[9-10]。因此建立一种R，S-构型阿雷地平的分离及异构体检查方法显得尤为重要。目前，国内外仅有阿雷地平及其代谢产物的含量测定方法报道[11-12]，或其他二氢吡啶类对映体的拆分方法[13-14]，尚未有阿雷地平对映异构体拆分方法的相关文献报道。本文采用高效液相色谱法在正相条件下直接拆分阿雷地平对映异构体，所建立方法具有操作简便，灵敏度高，重复性好的特点。
|
图 1 阿雷地平结构式 Figure 1 Chemical structure of aranidipine |
Agilent 1260高效液相色谱系统（包括自动进样器、柱温箱、VWD检测器、Agilent Chemstation色谱数据工作站；Agilent公司）；Chiralcel OJ-H（250 mm×4.6 mm，5µm；填料：硅胶表面涂敷有纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）；Daicel公司）色谱柱；CP-225D电子天平（Sartorius公司）。
正己烷、乙醇为色谱纯。S-阿雷地平样品（批号20140522）及阿雷地平外消旋体（批号20140113）由江苏德源药业股份有限公司提供。S-阿雷地平及R-阿雷地平对照品（化学纯度分别为99.97%和99.95%；光学纯度≥99.96%）由实验室自制。
2 方法与结果 2.1 溶液配制对照品溶液：取R-阿雷地平或S-阿雷地平的对照品适量，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.5 mg的溶液，作为对照品储备液；精密移取对照品储备液适量，加无水乙醇稀释制成每1 mL中约含0.5 µg的溶液，作为对照品溶液。分离度测试溶液：取阿雷地平外消旋体约10 mg，置10 mL量瓶中，加无水乙醇适量，超声溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液：精密称取S-阿雷地平样品约25 mg，置50 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2 色谱条件色谱柱：Chiralcel OJ-H（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：正己烷-乙醇（75:25）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：238 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 µL。
2.3 分离度试验精密量取分离度测试溶液和对照品储备液各20 µL，注入液相色谱仪，记录色谱图。典型色谱图见图 2。结果表明，在选定的色谱条件下，S-阿雷地平峰与R-阿雷地平峰能较好地分离，分离度为3.50；理论板数分别为4727和4277。
|
1. R-阿雷地平（R-enantiomer of aranidipine，tR=10.252 min）2. S-阿雷地平（S-enantiomer of aranidipine，tR=12.653 min）A.阿雷地平消旋体溶液（aranidipine racemate solution）B. R-阿雷地平对照品储备液（R-aranidipine reference substance stock solution）C. S-阿雷地平对照品储备液（S-aranidipine reference substance stock solution） 图 2 阿雷地平对映体的拆分色谱图 Figure 2 Chromatograms of aranidipine enantiomeric separation |
取S-阿雷地平对照品及R-阿雷地平对照品溶液用无水乙醇逐级稀释，分别以基线噪声的10倍（S/N≈10）和基线噪声的3倍（S/N≈3）作为定量限和检测限。在选定的色谱条件下，S-阿雷地平的定量限为0.8 ng，检测限为0.4 ng；R-阿雷地平的定量限为0.8 ng，检测限为0.3 ng。
2.5 线性关系考察分别精密称取S-阿雷地平和R-阿雷地平的对照品适量，分别配制成0.04、0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 µg·mL-1的溶液，以质量浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线，得S-阿雷地平和R-阿雷地平的回归方程分别为：
A=59 204C+2.154 8 r=0.999 8
A=61 971C-0.321 48 r=0.999 9
结果表明，R-阿雷地平及S-阿雷地平质量浓度均在0.04~2.0µg·mL-1范围内，均呈良好的线性关系。R-阿雷地平相对于S-阿雷地平的校正因子为1.05。
2.6 回收率试验取S-阿雷地平样品约25 mg共9份，精密称定，分别置50 mL量瓶中，精密加入R-阿雷地平对照品溶液（25 µg·mL-1）0.5、1、2 mL各3份，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试溶液；另精密称取R-阿雷地平对照品适量，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.25、0.5和0.75 µg的溶液，作为对照品溶液。按“2.2”项下色谱条件分析，按外标法以峰面积计算，R-阿雷地平低、中、高3个浓度的回收率（n=3）分别为97.5%、98.5%、99.8%，RSD（n=9）为1.5%。
2.7 精密度试验精密称取S-阿雷地平样品约25 mg共6份，分别置50 mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按“2.2”项下色谱条件分析，以外标法以峰面积计算S-阿雷地平中R-阿雷地平浓度的RSD（n=6）为4.4%。按上述方法，于次日、以另外一个分析人员在另一台Agilent 1260高效液相色谱仪器上重复操作，计算S-阿雷地平中R-阿雷地平浓度的RSD（n=12）为4.6%。
2.8 溶液稳定性考察取“回收率试验”项下1份中浓度供试溶液于室温下避光放置0、2、4、8、12 h后分别进样，考察溶液稳定性。结果12 h内S-阿雷地平和R-阿雷地平峰面积的RSD分别为0.041%和0.41%，保留时间的RSD分别为0.30%和0.23%，表明供试溶液在12 h内稳定性良好。
2.9 S-阿雷地平中R-阿雷地平含量的测定取供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分析，按外标法以峰面积计算R-阿雷地平的含量，S-阿雷地平样品中R-阿雷地平的含量为0.08%。
3 讨论及结论 3.1 溶剂的选择阿雷地平在正己烷中几乎不溶，在无水乙醇中略溶[15]，所以选择无水乙醇为溶剂。
3.2 波长的选择取R-阿雷地平用无水乙醇溶解并稀释制成10 µg·mL-1的溶液，在200~400 nm波长范围内扫描，最大吸收波长为238 nm，故选择238 nm为检测波长。
3.3 流动相比例对分离的影响将流动相中正己烷-乙醇的比例分别调整为80:20、75:25以及70:30。结果显示，随着流动相中乙醇比例的增加，R-阿雷地平和S-阿雷地平的保留时间明显缩短，但两者的分离度由3.50变为2.53。随着流动相中乙醇比例的降低，R-阿雷地平、S-阿雷地平的保留时间明显延长（分别为13.234 min和16.812 min），造成有机溶剂的浪费。所以最终选择正己烷-乙醇（75:25）作为流动相。
3.3 流速对分离的影响以正己烷-乙醇（75:25）为流动相，柱温35℃，调节流速为0.8、1.0和1.2mL·min-1，考察不同流速对阿雷地平对映异构体分离的影响时发现，随着流速降低，R-阿雷地平、S-阿雷地平的理论板数明显增加，保留时间明显延长（分别为12.404 min和15.232 min），两者之间的分离度无明显变化；流速增加，分离度由3.50降低至3.27，色谱系统压力由4.43 MPa增加至5.24 MPa，不利于色谱柱的使用。因此选择1.0 mL·min-1流速作为试验色谱条件。
3.4 柱温对分离的影响以正己烷-乙醇（75:25）为流动相，流速1.0 mL·min-1，调节柱温为30、35和40 ℃，结果发现温度的升高或降低对R-阿雷地平和S-阿雷地平之间的分离度没有明显影响，但随着温度的升高，各成分色谱峰的理论板数会有所提高。从色谱柱使用寿命角度考虑，选择35 ℃柱温作为试验色谱条件。
3.5 小结本文建立了高效液相色谱法拆分测定S-阿雷地平的对映异构体，选定的色谱分析方法灵敏度高、分离度好、操作简便，可有效分离R和S构型的阿雷地平，为进一步了解S构型的阿雷地平奠定了基础。
| [1] |
OHNO S, KOMATSU O, MIZUKOSH IK, et al. Synthesis of asymmetric 4-aryl-1, 4-dihydro-2, 6-dimethyl-3, 5-pyridinedicar-boxylates with vasodilating and antihypertensive activities[J]. Chem Pharm Bull, 1986, 34(4): 1589. DOI:10.1248/cpb.34.1589 |
| [2] |
KANDA A, HARUNO A, MIYAKE H, et al. Antihypertensive effects of MPC-1304, a novel calcium antagonist, in experimental hypertensive rats and dogs[J]. J Cardiovasc Pharm, 1992, 20(5): 723. |
| [3] |
MIYOSHI K, KANDA A, MIYAKE H, et al. MPC-1304, another type of dihydropyridine, possessing highly potent vasodilating action[J]. Eur J Pharmacol, 1993, 238(2): 139. |
| [4] |
MASUMIYA H, TANAKA Y, TANAKA H, et al. Inhibition of T-type and L-type Ca2+ currents by aranidipine, a novel dihydropyridine Ca2+ antagonist[J]. Pharmacology, 2000, 61(2): 57. DOI:10.1159/000028381 |
| [5] |
IOAN P, CAROSATI E, MICUCCI M, et al. 1, 4-Dihydropyridine scaffold in medicinal chemistry, the story so far and perspectives (part 1):action in ion channels and GPCRs[J]. Curr Med Chem, 2011, 18(32): 4901. DOI:10.2174/092986711797535173 |
| [6] |
WANG S, HE L, YUN B. The difference between nicardipine and its enantiomers on inhibiting vasoconstriction of isolated rabbit thoracic artery[J]. Arch Pharm Res, 2005, 28(3): 319. DOI:10.1007/BF02977799 |
| [7] |
JABOR VA, COELHO EB, LANCHOTE VL. Enantioselective pharmacokinetics of lercanidipine in healthy volunteers[J]. J Chromatogr B, 2004, 813(1): 343. |
| [8] |
ZHANG XP, LOKE KE, MITAL S, et al. Paradoxical release of nitric oxide by an L-type calcium channel antagonist, the R+ enantiomer of amlodipine[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2002, 39(2): 208. DOI:10.1097/00005344-200202000-00007 |
| [9] |
OKUMURA K, ICHIHARA K, NAGASAKA M, et al. Calcium entry blocking activities of MPC-1304 and of its enantiomers and metabolites[J]. Eur J Pharmacol, 1993, 235(1): 69. DOI:10.1016/0014-2999(93)90821-X |
| [10] |
郭鹏程, 黄红林. 二氢吡啶类钙通道阻滞剂及其药物手性研究[J]. 现代生物医学进展, 2009, 9(1): 181. GUO PC, HUANG HL. Dihydropyridines calcium channel blockers and chiral drugs research[J]. Prog Mod Biomed, 2009, 9(1): 181. |
| [11] |
TIAN L, JIANG J, HUANG Y, et al. Determination of aranidipine and its active metabolite in human plasma by liquid chromatography/negative electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2006, 20(19): 2871. DOI:10.1002/(ISSN)1097-0231 |
| [12] |
ⅡDA Y, KINOUCHI Y, TAKEICHI Y, et al. Simultaneous determination of a new dihydropyridine calcium antagonist(MPC-1304) and its metabolite in dog plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection[J]. J Chromatogr A, 1991, 571(1-2): 277. DOI:10.1016/0378-4347(91)80456-M |
| [13] |
李成平, 曾怀超, 鲁琳, 等. 二氢吡啶钙拮抗剂马尼地平和西尼地平对映体的手性拆分研究[J]. 药物分析杂志, 2010, 30(4): 661. LI CP, ZENG HC, LU L, et al. Study on the chiral resolution of dihydropyridine calcium antagonistsmanidipine and cilnidipine enantiomers[J]. Chin J Pharm Anal, 2010, 30(4): 661. |
| [14] |
方应国, 丁潇潇, 严小平, 等. 非洛地平和尼莫地平对映体的手性拆分研究[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(10): 1762. FANG YG, DING XX, YAN XP, et al. Study on chiral resolution of felodipine and nimodipine enantiomers[J]. Chin J Pharm Anal, 2012, 32(10): 1762. |
| [15] |
赵蕊. 阿雷地平的合成研究[D]. 天津: 天津理工大学, 2011 ZHAO R. Synthesis of Aranidipine[D]. Tianjin:Tianjin University of Technology, 2011 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10060-1011203268.htm |