2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
制川乌-白芍药对来源于张仲景著述的《金匮要略》中记载的“乌头汤”，临床上常用来治疗“风湿痹证”。制川乌为毛茛科植物乌头Aconitum carmchaeli Dex.的母根，主要含有双酯型生物碱乌头碱(aconitine，AT)、次乌头碱(hypaconitine，HT)、新乌头碱(meaconitine，MT)以及毒性较低的单酯型生物碱苯甲酰乌头原碱(benzoylaconine，BA)、苯甲酰次乌头原碱(benzoylhypaconine，BH)、苯甲酰新乌头原碱(benzoylmesaconine，BM)6个酯型生物碱；白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloria Pall.的干燥根，主要含有芍药苷、芍药花苷等。制川乌配伍白芍后不仅能增强制川乌抗炎、镇痛等治疗作用，而且能降低其对心脏、神经等的毒副作用，从而达到“增效减毒”的配伍效果[1-3]。临床已证实，经皮给药是治疗“风湿痹证”最常用、最有效的给药方式之一，因此，本课题组前期采用微透析技术研究白芍对制川乌经皮给药局部药动学的影响发现，白芍可促进制川乌中部分单酯型生物碱的经皮吸收，抑制双酯型生物碱的经皮渗透[4]。本文采用经皮给药方式，利用LC-MS/MS技术，研究白芍对制川乌中6个酯型生物碱组织分布的影响，从组织分布的角度，进一步阐明制川乌白芍配伍的机制。
1 材料 1.1 仪器与试剂Applied Biosystems(AB)Triple Quad 4500液质联用仪器(Applied Biosystems(AB)公司)；Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm；EC-C18；安捷伦公司)；HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；DW-86L388A立式超低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司)；XH-C旋涡混合器(金坛市医疗仪器厂)；QGC-24T氮气吹干仪(上海泉岛公司)；FA2204B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)；羧甲基纤维素钠800-1200(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
1.2 药物与动物白芍提取物(每1 g提取物相当于白芍14.81 g；芍药苷含量为263.49 mg·g-1)、制川乌提取物(每1 g提取物相当于制川乌222.22 g；6个酯型生物碱含量分别为BM 23.24，BA 5.13，BH 2.06，MT 6.44，HT 1.78，AT 1.17 mg·g-1)均为自制[5]；对照品芍药苷、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、氢溴酸高乌甲素(lappaconite hydrobromide，LHI)(中国食品药品检定研究院，批号分别为110736-201337、111795-201102、111794-201102、111796-201002、110799-201106、110798-201307、101720-201111、100289-200902)；SD大鼠，体重(200±20) g，许可证号SCXK(湘)2011-0003。
2 方法与结果 2.1 分析条件参照本课题组已发表论文中的色谱和质谱条件[4]，采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)，以2 mmol·L-1乙酸铵溶液(每1 000 mL加1 mL甲酸)为流动相A，乙腈溶液(每1 000 mL加1 mL甲酸)为流动相B，梯度洗脱(0~0.5 min，25%B→25%B；0.5~3 min，25%B→ 70%B；3~3.5 min，70%B→70%B；3.5~4 min，70%B→25%B，4~6 min，25%B)，流速0.4 mL·min-1；采用多反应监测模式(MRM)，用于定量分析的离子对分别为m/z 585.3→m/z 535.4(LHI)、m/z 646.4→m/z 586.3(AT)、m/z 632.4→m/z 572.5(MT)、m/z 616.4→m/z 556.4(HT)、m/z 604.5→m/z 554.4(BA)、m/z 590.4→m/z 540.4(BM)、m/z 574.4→m/z 542.4(BH)，其中LHI为内标；碰撞诱导解离电压分别为43 V(LHI)、47 V(AT)、46 V(MT)、47 V(HT)、51 V(BA)、50 V(BM)、48 V(BH)。
2.2 混合对照品溶液的制备分别精密称取BM、BA、BH、MT、HT、AT对照品20.7、12.7、12.3、11.2、12.6、13.6 mg置10 mL的量瓶中，用异丙醇：三氯甲烷(1:1) 溶解，并稀释至刻度，配制成浓度分别为2.07、1.27、1.23、1.12、1.26、1.36 mg·mL-1单标储备液；分别精密吸取上述储备液适量，置于10 mL量瓶中，加乙腈定容至刻度，制成6个酯型生物碱质量浓度均为10 μg·mL-1的混合对照品母液；吸取上述母液适量，加乙腈制备成质量浓度为0.1、1、2、5、10、50、100、200、500 ng·mL-1的系列混合对照品溶液。
2.3 内标溶液的配制精密称取LHI对照品适量，用甲醇配制成10 μg·mL-1的内标母液；精密吸取母液适量，加甲醇制备成500 ng·mL-1的内标溶液，备用。
2.4 凝胶的制备取羧甲基纤维素钠1 g，加蒸馏水19 mL，搅拌溶解，室温放置24 h，充分溶胀后形成空白凝胶基质。分别称取制川乌0.19 g及白芍浸膏2.85 g(相当于生药比1:1)，空白凝胶基质6.96 g，搅拌混匀，即得制川乌白芍凝胶；取制川乌浸膏0.19 g及空白凝胶基质9.81 g，搅拌混匀，即得制川乌凝胶。
2.5 组织样品的处理[6-7]从超低温(-80 ℃)冰箱取出待测大鼠组织，室温解冻( < 30 ℃)，用滤纸吸干水分，分别称取心、肝、脾、肺、皮肤、脑组织适量，加4倍量生理盐水匀浆，肾组织加6倍量生理盐水匀浆，于4 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，取上清液，即为匀浆液，低温保存，备用。取匀浆液200 μL，加入内标溶液20 μL，再加少量25%氨水调pH至9~10，随后加乙酸乙酯800 μL，漩涡振荡2 min，4 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，静置后取上清液，重复提取1次，合并上清液，于28 ℃ N2气流下吹干，加入25 %乙腈溶液120 μL，漩涡2 min，12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min后，取上清液待分析。
2.6 方法学考察 2.6.1 专属性考察取空白组织、空白组织加混合对照品溶液与内标溶液、给药5 d后取得的组织样品匀浆液，按“2.5”项下的方法处理后，按“2.1”项条件进样分析，考察是否有内源性物质干扰。结果显示组织中其他成分对6个酯型生物碱成分的测定无干扰，6个酯型生物碱成分无相互干扰，峰形良好。以皮肤组织为例，离子流色谱图见图 1。
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图 1 皮肤离子流色谱图 Figure 1 Ion current chromatograms of skin tissues |
分别吸取上述系列混合对照品溶液100 μL加入到100 μL空白组织匀浆液中，即得质量浓度为0.05、0.5、1、2.5、5、25、50、100、250 ng·mL-1标准组织样品，按“2.5”项下方法操作，进样测定。以待测物峰面积与内标峰面积的比值Y对相应的质量浓度X(ng·mL-1)进行线性回归，用加权(w=1/x2)最小二乘法进行回归运算，得各个组织样品标准曲线及回归方程。结果表明，6个酯型生物碱在心、肝、脾、肺、肾、脑组织中的线性范围为0.05~100 ng·mL-1，皮肤中的线性范围为0.05~250 ng·mL-1，线性关系良好，定量限为0.05 ng·mL-1；取对照品溶液逐级稀释，通过测定峰高和基线噪音，按信噪比3:1确定检测限为0.01 ng·mL-1。
2.6.3 精密度和准确度考察配制各组织低、中、高3个浓度(0.5、5、50 ng·mL-1)的标准组织样品作为质控样品，各浓度平行配制5份，按“2.5”项下方法操作，测定批内精密度和准确度。按同样方法连续测定3批，计算批间精密度。结果表明，各组织中6个酯型生物碱的准确度均在85% ~115%之间，批内、批间精密度均在15%之内，符合生物样品测定要求。
2.6.4 稳定性考察取各组织低、中、高3个浓度(0.5、5、50 ng·mL-1)质控样品，每个浓度平行配制3份，分别考察样品于室温放置24 h、-70 ℃冻存15 d和反复冻融3次的稳定性。以测定值的平均值与配制的理论浓度(加入值)比较，计算相对误差。结果表明，各组织样品在这3种保存条件下稳定性良好。
2.6.5 提取回收率测定分别取1、10、100 ng·mL-1的混合对照品溶液100 μL，加入内标溶液20 μL，28 ℃ N2气流下吹干，加入25 %乙腈溶液120 μL，漩涡2 min，12 000 r·min-1，4 ℃离心10 min后，取上清液进样分析，记录6个酯型生物碱峰面积，记为A1。再平行制备各组织低、中、高3个浓度(0.5、5、50 ng·mL-1)质控样品5份，按“2.5”项下方法操作，测定，记录6个酯型生物碱峰面积，记为A2。以A2/A1×100%的值计算提取回收率。结果表明，各组织中6个生物碱的提取回收率的RSD均在15%以内，符合生物样品测定要求。
2.6.6 基质效应取1、10、100 ng·mL-1的混合对照品溶液100 μL，加入蒸馏水100 μL，再加入内标溶液20 μL，按“2.5”项下方法操作，进样测定，记录对照品与内标峰面积比值，记为A3。取空白组织匀浆液200 μL，加乙酸乙酯800 μL，漩涡振荡2 min，4 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，静置后取上清液，重复提取1次，合并上清液，N2气吹干，分别加入1、10、100 ng·mL-1混合对照品溶液100 μL和内标溶液20 μL复溶，测定，记录对照品与内标峰面积比值，记为A4；每个浓度平行制备3份，以A4/A3×100%的值计算基质因子。结果表明不存在明显的基质效应，各组织中6个酯型生物碱的基质因子均在85%~115%范围内，RSD均小于12%。
2.7 体内分布研究 2.7.1 分组及给药18只SD大鼠，雌雄各半，实验前1 d用推剪除毛。给药前禁食不禁水12 h，随机分配到制川乌组、制川乌-白芍组，每组9只；分别经皮给予上述2组药物凝胶4.75 mg·g-1大鼠[8](两组凝胶中6种酯型生物碱含量相等，分别含BM 0.442、BA 0.097、BH 0.039、MT 0.122、HT 0.034、AT 0.022 mg·g-1)。每天1次，连续经皮给药5 d，于第5天给药后4、8 h取相应的大鼠断头处死，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、脑、皮肤组织，用生理盐水洗除残余血液，滤纸吸干，称重，装入自封袋中，-70 ℃冰冻保存备用；凝胶制剂中药物可较长时间匀速或接近匀速释放，组织中药物浓度亦会持续升高，考虑到外用制剂的经皮应用时间，同时为在较短时间内考察药物的消除情况，因此其余大鼠于第5天给药后8 h后，祛除药物并用蒸馏水洗净给药部位皮肤，再经12 h后将大鼠断头处死，同法取出组织，装入自封袋中，-70 ℃冰冻保存备用。
2.7.2 组织样品测定制川乌单用经皮给药后，6个生物碱在大鼠体内分布较广，主要分布在皮肤，其次为肝、脾、肺、肾，而在脑、心脏中的分布量较低；与制川乌组比较，经皮给药4 h后，皮肤中单酯型生物碱BM、BA的量明显增加(P < 0.05)，而双酯型生物碱MT、AT和HT在给药4、8 h后的量均显著减少(P < 0.05)，表明制川乌与白芍配伍，可促进部分单酯型生物碱的分布与吸收，而抑制了双酯型生物碱的经皮吸收；6个生物碱在脑组织亦有分布，但配伍可以改变其分布规律，与单用组比较，经皮给药4、8、20 h后，配伍组脑组织中BA、BH的量均显著下降(P < 0.05)，8 h后AT显著降低(P < 0.05)，同时，给药20 h后，BM、HT亦明显减少(P < 0.01)，且未检测到BA和BH，表明配伍降低了部分单、双酯型生物碱在脑内分布，这可能与制川乌白芍配伍增加靶器官药物的分布而“增效”，降低在中枢神经等毒靶器官的分布而“减毒”有关；在心脏组织中，给药4 h后，配伍组中3个单酯型生物碱较制川乌单用组的含量均显著减少(P < 0.05)；8、20 h后，6个生物碱均明显降低(P < 0.05)，同时20 h后，在心脏组织中已检测不到BA、BH、MT和AT，这亦与配伍降低心脏毒性存在相关性。在肾脏、肝脏、肺、脾组织中，主要表现为配伍降低了3个双酯型生物碱在其中的分布，这可能与配伍降低双酯型生物碱的吸收而导致药物在肾脏、肝脏、肺、脾中分布量下降有关。结果见表 1。
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表 1 经皮给药后各时间点6个生物碱在大鼠组织中的分布(n=3) Table 1 Distribution of six aconite alkaloids in different tissues of rat at various time points after transdermal administration |
制川乌经皮给药，药物在皮肤组织的分布与药物的吸收密切相关，同时，制川乌的毒性主要表现为神经、心脏毒性，因此，在以上t检验的基础上，进一步应用主成分分析法(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘判别法(partial least quares discriminant analysis，PLS-DA)综合分析配伍对6个酯型生物碱在皮肤及毒靶器官心脏、脑组织中分布的影响。本实验给药方案为连续给药5 d，于末次给药8 h祛除药物，因此在0~20 h考察的范围内，8 h时组织中的药量为峰值，因此，以皮肤、心脏和脑组织中8 h测得的6个生物碱含量为特征变量值，分别进行PCA和PLS-DA分析。由PCA主成分得分图可知，在皮肤、心脏和脑等3个组织中，配伍组与单用组之间的样本点可以完全区分，说明与制川乌组比较，配伍后6个生物碱在皮肤、心脏、脑组织中的分布有显著性差异。从变量重要性图VIP(variable importance plot)可知，皮肤中3个双酯型生物碱HT、AT、MT的VIP均大于1，说明双酯型生物碱对区分配伍组和制川乌单用组的贡献率更大，综合以上t检验结果，进一步表明配伍对双酯型生物碱经皮吸收的抑制效应大于单酯型生物碱促进效应，总体上表现为“减毒”；心脏组织中MT、AT、BA、BH的VIP大于1，同时，在脑组织中AT、BH、BA的VIP大于1，特别是毒性较大的AT在心脏、脑组织中的VIP均较大，以上结果表明配伍不但降低了双酯型生物碱，特别是AT在心脏、脑组织的分布，同时降低了单酯型生物碱的分布，这可能与制川乌配伍白芍降低心脏、中枢神经毒性有关。PCA见图 2，VIP见图 3。
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A.皮肤(skin) B.心脏(heart) C.脑(brain) Class 1：制川乌组(Aconiti Radix Cocta group) Class 2：制川乌-白芍组(Aconiti Radix Cocta-Paeoniae Radix Alba group) 图 2 组织分布PCA图 Figure 2 PCA plots of distribution in tissues |
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A.皮肤（skin）B.心脏（heart）C.脑（brain） 图 3 组织分布VIP图 Figure 3 VIP plot of distribution in tissues |
目前，针对制川乌-白芍药对配伍机制的研究多采用口服等非外用给药途径，而现代生物药剂学研究表明，给药途径是影响药物吸收、分布、代谢、排泄过程的重要因素。药物经皮吸收时，药物透过角质层进入活性表皮，扩散至真皮被毛细血管吸收进入体循环，而口服时药物主要通过小肠微绒毛单层细胞进入血液，再通过门静脉入肝后到达体循环，因此，经皮给药与口服给药在吸收、分布时转运阻力不同，同时皮肤中的药物代谢酶在药物经皮转运时可能使药物发生生物转化，而皮肤中的代谢酶与口服给药所接触的代谢酶在种类与数量方面均存在较大差异，因此，给药途径不同必然导致药物的体内过程的改变。本文从经皮转运的角度研究制川乌-白芍配伍对6个酯型生物碱的分布的影响，为中药配伍机理研究提供新视角。
本实验研究结果表明，制川乌配伍白芍后促进了单酯型生物碱BM、BA的在皮肤组织的分布，而双酯型生物碱在皮肤组织中的分布量减少，表明制川乌配伍白芍具有“增效减毒”作用，研究结果与本课题前期在体微透析研究结果[4]相一致。白芍对制川乌中单酯型生物碱、双酯型生物碱在皮肤中的分布呈现“促进抑制”相反效应，可能与白芍中芍药苷与单、双酯型生物碱形成“离子对”而导致生物碱的脂溶性发生改变有关[9]。
制川乌中生物碱既是有效成分又是毒性成分，主要表现为神经、心脏毒性[10-11]。本实验结果显示，制川乌配伍白芍后降低了生物碱在心脏、脑组织的分布，表明制川乌配伍白芍具有“减毒”作用。文献报道[15]芍药苷为P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)的底物，且能降低维拉帕米对P-gp蛋白的抑制作用。因此，制川乌-白芍配伍可能影响P-gp的活性，从而影响AT等毒性成分在中枢神经系统的分布而起到“减毒”作用。后续研究中，将采用Western Blot、RT-PCR等方法研究配伍对P-gp蛋白的表达，以及MDR1a基因的影响，进一步阐明制川乌-白芍配伍机制。
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