咳喘平散是由细辛、五味子、白芥子、僵蚕、麻黄、炒白果仁6味药材组成的外用复方制剂，主要用于小儿风寒咳嗽、气喘等症。其中细辛具有温肺化饮功效，临床用于治疗痰饮喘咳等；五味子具有收敛固涩之功，临床可用于久嗽虚喘^[1-2]；细辛配伍五味子功擅温肺化饮，止咳平喘，两者一散一敛，令邪气去而不伤正，二者配伍具有抗哮喘活性^[3]。同时现代药理研究表明：白芥子具有明显的镇咳、祛痰、平喘作用^[4]，芥子碱硫氰酸盐通过舒张平滑肌具有平喘作用^[5]；本试验选取白芥子、细辛、五味子中的主要成分芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素、五味子甲素、五味子乙素进行含量测定，以便对咳喘平散的质量进行多方位控制。

目前咳喘平散的医院制剂质量标准中只建立了芥子碱硫氰酸盐的TLC定性鉴别方法，为了有效、全面地控制该产品的质量，以上述成分为指标成分，建立了相应的HPLC含量测定方法。作者查阅相关文献，上述4种成分的含量测定目前主要采用HPLC法；其中单个或部分成分进行含量测定的方法已有文献报道^[6-7]；但同时测定上述4种成分者未见报道。作者参考相关文献^[8-16]建立了同步测定该制剂4种成份含量的HPLC方法，结果表明该方法简便，结果准确，重复性好，可用于咳喘平散的质量控制。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，2996型二极管阵列检测器，Empower工作软件；Agilent ZORBAX SB-AQ C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)；Sartorius CP225D型电子天平。

1.2 试药

对照品芥子碱硫氰酸盐(批号111702-201303，供含量测定用)、细辛脂素(批号111889-201203，供含量测定用)、五味子甲素(批号110764-200408，供含量测定用)、五味子乙素(批号110765-200205，供含量测定用)均购于中国食品药品检定研究院。

处方饮片来源：河南中医药大学第一附属医院中药饮片库房；咳喘平散样品由河南中医药大学第一附属医院中药制剂实验室提供，批号为150617、150115、150303；HPLC用乙腈色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB-AQ C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.08 mol·L^-1磷酸二氢钠水溶液(B)，梯度洗脱(0~19 min，12%A；19~20 min，12%A→52%A；20~48 min，52%A→56%A)，流速1.0 mL·min^-1，柱温30 ℃，检测波长286 nm(芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素)、220 nm(五味子甲素、五味子乙素)，进样量10 μL。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液

分别精密称取细辛脂素、五味子甲素、五味子乙素的对照品适量，用甲醇溶解并配制成质量浓度分别为0.508、0.646、0.434 mg·mL^-1的各对照品储备溶液；精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品13.55 mg，用70%甲醇水溶解配制成质量浓度为0.542 mg·mL^-1的芥子碱硫氰酸盐对照品储备液。精密量取芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素、五味子甲素、五味子乙素的对照品储备液分别为2.2、0.60、0.55、0.80 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

取样品适量研细，取粉末约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水16 mL，密塞，称量，超声(功率250 W，频率40 kHz)处理25 min，放冷至室温，精密称定，用70%甲醇水补足减失的量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液

按照咳喘平散的处方比例和制备工艺，分别制备缺白芥子、细辛、五味子的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备各阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和各阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果表明芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素、五味子甲素、五味子乙素与其他峰分离度良好，阴性无干扰，见图 1。

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样2、4、6、10、15 μL，测定峰面积；以对照品进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归，数据见表 1。

2.5 方法学考察 2.5.1 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，结果芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为1.1%、0.9%、0.6%、0.7%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验

取同一批(批号150617) 咳喘平散样品6份。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素、五味子甲素、五味子乙素平均含量分别为1.517、0.497、0.425、0.514 mg·g^-1，RSD分别为1.5%、1.1%、1.1%、1.3%，表明方法的重复性较好。

2.5.3 稳定性试验

精密吸取同一咳喘平散供试品溶液10 μL，分别在0、2、6、12、16、20 h进样，结果芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为1.6%、1.6%、1.2%、1.4%，表明供试品溶液在20 h内较稳定。

2.5.4 加样回收率试验

精密称取6份已知含量的同一批(批号150617) 咳喘平散样品粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入各对照品储备溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表 2。

2.6 样品测定

取3个批号的咳喘平散样品，每批3份，按“2.2.2”项下方法分别制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，记录峰面积，以标准曲线法分别计算各成分的含量，结果见表 3。

3 讨论

咳喘平散中化学成分复杂，本试验采用梯度洗脱，能对方中多种待测成分进行较好的分离，确保分离度好、峰形对称、检测灵敏度高，结果准确。

参考相关文献，试验中曾选用不同溶剂系统(乙腈-0.2%甲酸水溶液、甲醇-0.08 mol·L^-1磷酸二氢钠水溶液)作为流动相进行考察，结果表明，本实验所用流动相具有分离度高，峰形好，干扰少的特点。

芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素、五味子甲素、五味子乙素紫外吸收相差较大，为保障阴性无干扰且分离度较好，最终确定各成分检测波长如下：286 nm(芥子碱硫氰酸盐、细辛脂素)，220 nm(五味子甲素，五味子乙素)。

3批样品测定结果表明，各批次样品之间化合物的含量有一定差别，表明中药制剂应加强原料药质量控制，从各方面保证原料药质量，进而使制成品质量获得保证。

本试验操作方法简便、准确、专属性强，重复性好，能进一步完善咳喘平散的质量控制，为咳喘平散及类似组方制剂的质量评价提供参考。