2017, Vol. 37 
2. 江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心, 南京 210046;
3. 南京市中医院, 南京 210001;
4. 江苏省食品药品检验所, 南京 210008
2. Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM, Nanjing 210046, China;
3. Nangjing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing, 210001, China;
4. Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China
胃乐宁片是由猴头菌丝及固体培养物提取并加辅料压制而成，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十八册[1]，具有养阴和胃的功效。临床常用于胃脘疼痛、痞满、腹胀及胃、十二指肠溃疡、慢性萎缩性胃炎等症[2]。根据文献报道，猴头菌丝的主要活性成分包括甾醇[3]、多糖[4]、低聚糖[5]、芳香环类[6]、二萜类[7]等。近年来的研究表明，甾醇类物质对胃黏膜有保护作用[8]。皮质甾醇处理过的小鼠可以增强胃内抗细菌感染的能力[9]。麦角甾醇是真菌类的特征甾醇，具有调节真菌细胞膜流动性的功能，在确保膜结构的完整性、与膜结合酶的活性、细胞活力以及物质运输等方面起着重要作用[10]，同时也是一些中药及中药制剂的指标性成分[11-12]。据国内研究报道，β-谷甾醇具有降低阿司匹林引发胃黏膜损伤的作用[13]，国外研究也表明，β-谷甾醇具有抵抗多种胃溃疡模型的胃黏膜保护效果[14]。
现有文献显示，胃乐宁片及猴头菌丝(及固体培养物)的含量测定多局限于腺苷、麦角甾醇和多糖等[15-17]，未见对麦角甾醇和β-谷甾醇同时测定的报道。现行部颁标准胃乐宁(WS3-B-3457-98) 项下仅有理化鉴别与检查项[18]。为更好地控制该药质量，本研究建立同时测定猴头菌丝固体培养物及胃乐宁片中麦角甾醇和β-谷甾醇HPLC-ELSD方法，为其质量控制提供实验依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters e2695高效液相色谱系统(包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，2424蒸发光散射检测器和CTO-20A柱温箱；Waters公司)；Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Eka-Nobel公司)；Anke TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；Thermo Scientific HeraeusMultifuge X1R通用台式离心机(Thermo公司)；FA1204B电子分析天平(上海精密科学有限公司)；Milli-Q Synthesis 108超纯水仪(密理博公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 试药甲醇为色谱纯，乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷为分析纯，重蒸水由Milli-Q Synthesis 108超纯水仪制得。麦角甾醇对照品(批号111845-201403) 购自中国食品药物检定研究院，β-谷甾醇(批号BCTG-0013，含量≥98%)购自中国固体制剂制造技术国家工程研究中心。猴头菌丝固体培养物(南京老山药业有限公司)，批号分别为20141108、140113、150603、141122-1、141210-2、150703、140316、141026-1、141104-2、141122-2；胃乐宁片(南京老山药业有限公司)，批号分别为151009、151101、150507、150609、150804、151001、150902、141104、150808、150607，规格每片0.13 g。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇，流速1 mL·min-1，蒸发光散射检测器检测，增益500，雾化气为N2，气体压力275.8 kPa，漂移管温度70 ℃，喷雾器模式为加热，动力级别为65%，柱温35 ℃，进样量20 μL。
2.2 溶液制备 2.2.1 混合对照品溶液精密称取麦角甾醇和β-谷甾醇的对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含283 μg和249 μg的混合溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液取猴头菌3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯50 mL，密塞，称量，超声处理(功率250 W，50 kHz)90 min，放冷，再称量，用乙酸乙酯补足减失的量，摇匀，10 000 r·min-1离心10 min，精密量取上清液25 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得猴头菌丝固体培养物供试品溶液。取胃乐宁40片，精密称定，研细，取约4 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇饱和的正己烷50 mL，密塞，称量，超声处理(250 W，50 kHz)60 min，放冷，再称量，用甲醇饱和的正己烷补足减失的量，摇匀，10 000 r·min-1离心10 min，精密量取上清液25 mL，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得胃乐宁片供试品溶液。
2.2.3 阴性样品溶液取缺猴头菌丝固体培养物阴性样品，依“2.2.2”项下相应方法操作，即得猴头菌丝固体培养物阴性样品溶液。参照制剂的工艺过程，按处方比例配制不含猴头菌丝固体培养物的阴性样品，依“2.2.2”项下相应方法操作，即得胃乐宁片阴性样品溶液。
2.3 系统适用性及专属性试验取混合对照品溶液、猴头菌丝固体培养物供试品溶液、胃乐宁片供试品溶液及阴性样品溶液分别按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，结果麦角甾醇和β-谷甾醇的理论塔板数(n)均不低于15 000，与相邻成分达到基线分离，且阴性对照无干扰。色谱图见图 1。
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1.麦角甾醇(ergosterol) 2.β-谷甾醇(β-sitosterol) 图 1 混合对照品(A)、猴头菌丝固体培养物样品(B)、猴头菌丝固体培养物阴性样品(C)、胃乐宁片样品(D)、胃乐宁片阴性样品(E)色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), sample of solid cultures of Hericium mycelium(B), negative sample of solid cultures of Hericium mycelium(C), sample of Weilening tablets(D)and negative sample of Weilening tablets(E) |
精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液(含283.04 μg·mL-1麦角甾醇和249.36 μg·mL-1 β-谷甾醇)5 mL于10 mL量瓶中，以甲醇稀释定容，依次用二倍稀释法配制系列混合对照品溶液(包括母液在内的含283.04、141.52、70.76、35.38、17.69 μg·mL-1麦角甾醇和249.36、124.68、62.34、31.17、15.58 μg·mL-1 β-谷甾醇的5个浓度的溶液)；精密吸取20 μL进样测定。以对照品浓度的常用对数X为横坐标，峰面积的常用对数Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算得麦角甾醇、β-谷甾醇回归方程：
Y=1.496 5X+3.927 8 r=0.999 2
Y=1.551X+3.794 3 r=1.000
结果表明麦角甾醇质量浓度在17.69~283.04 μg·mL-1范围内，β-谷甾醇质量浓度在15.58~ 249.36 μg·mL-1范围内，浓度的常用对数值与峰面积的常用对数值呈良好的线性关系。
2.5 检测限与定量限的考察将麦角甾醇和β-谷甾醇混合对照品溶液逐步稀释后进样，以信噪比(S/N)为3测得麦角甾醇与β-谷甾醇检测限分别为2.21和1.95 μg·mL-1，以信噪比(S/N)为10测得麦角甾醇与β-谷甾醇定量限分别为8.84和7.79 μg·mL-1。
2.6 精密度试验精密吸取上述混合对照品溶液20 μL，连续进样6次，测定麦角甾醇和β-谷甾醇的峰面积。结果麦角甾醇和β-谷甾醇色谱峰面积的RSD分别为2.1%和1.9%，结果表明，仪器精密度良好。
2.7 重复性试验分别取猴头菌丝固体培养物样品(批号20141108) 和胃乐宁片样品(批号150607)，分别按“2.2.2”项下相应的方法各制备6份供试品溶液。分别吸取“2.2.1”项下制备的混合对照品溶液与供试品溶液各20 μL，在“2.1”项条件下进样测定，按外标两点对数方程计算麦角甾醇和β-谷甾醇含量。结果见表 1。
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表 1 重复性试验结果(n=6) Table 1 Results of replicate test |
取同一份猴头菌丝固体培养物(批号20141108) 的供试品溶液和胃乐宁片(批号150607) 的供试品溶液，在“2.1”项条件下分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测得猴头菌丝固体培养物中麦角甾醇和β-谷甾醇的峰面积的RSD分别为1.2%和2.1%，胃乐宁片中麦角甾醇和β-谷甾醇的峰面积的RSD分别为2.5%和2.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.9 加样回收率试验取已知麦角甾醇和β-谷甾醇含量的猴头菌丝固体培养物样品(批号20141108) 和胃乐宁片样品(批号150607) 各6份，每份约1.5 g，精密称定，分别精密加入麦角甾醇对照品和β-谷甾醇对照品适量，分别按“2.2.2”项下相应的方法制备供试溶液；分别吸取“2.2.1”项下制备的混合对照品溶液与供试溶液各20 μL，在“2.1”项条件下进样测定，按外标两点对数方程计算麦角甾醇和β-谷甾醇的量，结果见表 2和表 3。根据2015年版中国药典[16]规定，该方法具有良好的准确性。
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表 2 猴头菌丝固体培养物的回收率试验结果 Table 2 Recoveries of Hericium mycelium with solid cultures |
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表 3 胃乐宁片的回收率试验结果 Table 3 Recoveries of Weilening tablets |
取各10个批次的猴头菌丝固体培养物和胃乐宁片的样品，分别按照“2.2.2”项下相应的方法制备供试品溶液；分别吸取“2.2.1”项下制备的混合对照品溶液与供试溶液各20 μL，在“2.1”项条件下进样测定，按外标两点对数方程计算麦角甾醇和β-谷甾醇的量，结果见表 4和表 5。
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表 4 猴头菌丝固体培养物含量测定结果(n=3) Table 4 Contents of solid cultures of Hericium mycelium |
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表 5 胃乐宁片的含量测定结果(n=3) Table 5 Contents of Weilening tablets |
本试验对提取溶剂、提取方法、超声时间、料液比等单因素进行考察，筛选以乙酸乙酯作为猴头菌丝固体培养物的提取溶剂，料液比为3︰50，50 kHz频率下超声90 min，提取率最高；但以乙酸乙酯作为胃乐宁片的提取溶剂，提取率并不高，可能原因是胃乐宁片中淀粉、糊精等糖类辅料的影响，故最终考察结果是以甲醇饱和的正己烷作为胃乐宁片的提取溶剂，料液比为4︰50，50 kHz频率下超声60 min，提取率最高。
3.2 耐用性实验在耐用性试验中分别考察了以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的3种不同品牌的C18色谱柱[Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo Scientific Syncronis C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)]、不同流速(0.9、1.0和1.1 mL·min-1)和不同的柱温(33、35和37 ℃)等对提取的影响，结果表明在既定的色谱条件下，Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)能达到较好的分离效果，峰形较好，故选用Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。色谱条件的微小变化对测定结果影响不大(RSD均小于1%)。
3.3 检测器的选择β-谷甾醇除在紫外末端有吸收外，未见其他紫外吸收峰，用紫外法测定时，存在基线漂移不稳，响应值小等缺点，不易测定。ELSD是一种通用型检测器，能够适用所有物质的测定，且无溶剂峰干扰，基线平稳，便于定性与定量，因此本实验选择ELSD检测器。
3.4 小结本实验采用HPLC-ELSD方法，同时测定猴头菌丝固体培养物及胃乐宁片中麦角甾醇和β-谷甾醇含量，通过对方法考察，结果表明，所建立的检测方法中，各成分精密度、稳定性、重复性良好，加样回收率实验结果符合定量分析的要求，方法简便易行，可为胃乐宁片的质量标准的建立和完善提供科学依据。
有2批胃乐宁片未测出麦角甾醇和β-谷甾醇(表 5)，这可能的原因是猴头菌丝固体培养物制备为胃乐宁的过程中某些操作导致一些批次中麦角甾醇和β-谷甾醇损失较大，针对这一问题实验室将进行后续试验探究原因。
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