灵芝广泛分布在中国、日本和南韩等地区，有200多个品种，又被称为神芝、芝草、木灵芝等^[1-2]。灵芝孢子粉在生物学上被称为“担孢子”，是灵芝的生殖细胞，主要含有的活性成分有灵芝多糖、多肽、三萜类、氨基酸、核苷酸、蛋白质等^[3-6]。灵芝孢子油是使用超临界CO₂萃取技术从灵芝孢子中提取的脂质活性物质，通常每10 g灵芝孢子粉才能萃取出1 g灵芝孢子油，是灵芝孢子有效成分的集合体。其药理作用有抗肿瘤^[7-10]、保肝^[11-12]、降血糖、降血脂^[13]，防治白血病^[14]等。最新药理实验表明灵芝孢子油具有扶正、减轻放化疗毒性之功效，一般认为灵芝孢子油的临床作用与其含有丰富的不饱和脂肪酸特别是油酸、亚油酸有密切的关系。有机酸成分含量测定的方法有气相色谱法^[15]、反相高效液相色谱法^[16]、离子色谱法^[17]及毛细管电泳法^[18]等。本文采用三氟化硼-甲醇甲酯化，HP-FFAP色谱柱分离，同时测定灵芝孢子油的7个脂肪酸，方法简单易操作，重复性、回收率均较好，实现了一次性完成多个指标的检测工作，从而提高了检测工作效率。

1 仪器与试药 1.1 仪器

安捷伦7890A气相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；HP-FFAP(30 mm×0.32 mm×250 μm；填料：硝基对苯二酸改性的聚乙二醇；安捷伦公司)毛细管色谱柱；漩涡混匀器(艾卡仪器设备有限公司)；水浴恒温振荡器(扬州市培英实验仪器有限公司)；电子天平XS205 XS204(梅特勒-托利多国际股份有限公司)。

1.2 试药

灵芝孢子油购自于仙芝楼生物科技有限公司、元生泰医药科技有限公司、南京中科集团股份有限公司、广东粤微食用菌技术有限公司。肉豆蔻酸(十四烷酸)对照品，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度≥99.5%，批号71018；十五烷酸对照品，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，≥99.5%，批号81230；棕榈酸(十六烷酸)对照品，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，≥99.5%，批号71126；十七烷酸，Fluka公司，≥99%，批号51610；硬脂酸(十八烷酸)对照品，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，≥99.5%，批号60323；油酸(十八烯酸)对照品，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，≥98.3%，批号00630；亚油酸，中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号111622-200602。氢氧化钾、甲醇及14%三氟化硼甲醇为分析纯，正己烷为色谱纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：HP-FFAP(30 mm×0.32 mm×250 μm)色谱柱；进样口温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃；柱温：初始温度200 ℃，保持4 min，以5 ℃·min^-1升至230 ℃，保持6 min；载气：高纯氮；柱流速：1 mL·min^-1；尾吹流速：30 mL·min^-1；氢气流速：40 mL·min^-1；空气流速：400 mL·min^-1；分流比50:1；进样量：1 μL。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液

精密称定7个脂肪酸对照品各10 mg，置于同一10 mL具塞刻度试管中，加入0.8 mol·L^-1氢氧化钾甲醇溶液2 mL，在水浴恒温振荡器中60 ℃水浴20 min，冷却至室温，加14%三氟化硼甲醇2 mL，振摇，于60 ℃中水浴15 min，取出，冷却至室温，精密加入正己烷2 mL，摇匀，加饱和氯化钠溶液2 mL，静置分层，取上清液即得。

2.2.2 供试品溶液

取灵芝孢子油样品0.1 g，精密称定，置于10 mL具塞刻度试管中，加入0.8 mol·L^-1氢氧化钾甲醇溶液2 mL，在水浴恒温振荡器中60 ℃水浴20 min，冷却至室温，加14%三氟化硼甲醇2 mL，振摇，于60 ℃中水浴15 min，取出冷却至室温，精密加入正己烷2 mL，摇匀，加饱和氯化钠溶液2 mL，静置分层，取上清液即得。

2.3 测定法

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，测定。

2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察

称取各对照品适量，置于同一具塞试管中，按“2.2.1”项下方法处理，将上清液稀释成不同浓度的系列对照品溶液，精密吸取1 μL按上述色谱条件进样测定。以质量浓度X(μg·mL^-1)为横坐标，相应峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，求出各脂肪酸标准曲线的回归方程和相关系数，结果见表 1。

2.4.2 检测限及定量限的测定

将混合对照品溶液逐步稀释后进样1 μL，信噪比为3左右时测得的浓度为检测限，信噪比为10左右时测得的浓度为定量限。结果见表 2。

2.4.3 稳定性试验

取同一灵芝孢子油样品(批号20141217) 的供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸含量的RSD分别为2.0%、2.8%、1.4%、2.7%、1.8%、1.4%和1.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验

取同一灵芝孢子油样品(批号20141217)6份，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。各脂肪酸平均含量及RSD结果见表 3，表明该法重复性良好。

2.4.5 回收率试验

取已知含量的灵芝孢子油样品(批号20141217)6份，各精密加入一定量脂肪酸对照品，按“2.2.2”项方法制备供试溶液，进样测定，计算回收率，结果见表 4。

2.5 样品测定

取灵芝孢子油样品的供试品溶液，按上述条件测定，通过回归方程计算，求得各脂肪酸的含量，结果见表 5。

3 讨论 3.1 皂化时间的选择

本文曾对皂化时间(5、10、15、20、30、60 min)进行考察，结果显示随着皂化时间的增加，各脂肪酸的含量先升高后降低，当皂化时间为20 min时灵芝孢子油样品已皂化完全，故选皂化20 min为本次实验的最佳皂化时间。

3.2 甲酯化时间的选择

本文曾对甲酯化时间(1、3、5、10、15、20 min)进行考察，结果显示随着甲酯化时间的增多，各脂肪酸含量先升高后降低，当甲酯化15 min时，灵芝孢子油样品已甲酯化完全，故选甲酯化15 min为本次实验的最佳甲酯化时间。

3.3 氢氧化钾甲醇浓度的选择

本文曾对氢氧化钾甲醇浓度(0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mol·L^-1)进行考察，结果显示0.8 mol·L^-1时，灵芝孢子油样品已皂化完全，故选氢氧化钾甲醇浓度0.8 mol·L^-1为本次实验的最佳皂化浓度。

4 结论

从以上测定结果可以看出：在灵芝孢子油脂肪酸中，不饱和的脂肪酸约占总量的76.41%，以油酸和亚油酸为主，含量分别为60.33%、16.08%；饱和脂肪酸占总量的18.05%，以棕榈酸和硬脂酸为主，含量分别为14.63%、3.42%，还检出少量的肉豆蔻酸、十五烷酸和十七烷酸，分别为0.30%、0.52%和0.24%。即灵芝孢子油中脂肪酸的含量达94%。