2017, Vol. 37 
注射用血栓通(冻干)具有活血祛瘀、通脉活络的功效，主要用于治疗淤血阻络、中风偏瘫、胸痹心痛、视网膜中央静脉阻塞等症[1-2]，该药是由三七总皂苷做成的冻干粉针剂，为中风后临床常用治疗药物之一。文献报道注射用血栓通(冻干)含有近100种皂苷类成分，其中以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 5个皂苷含量最高[3-7]。
中药具有多成分、多靶点的特点，这就意味着通过控制单一成分很难全面控制其质量，需要对其进行多成分同时测定，然而，定量指标成分的增多，也相应地带来了检测周期、成本的增加。为了解决这一问题，王智民等[8]提出了“一测多评”法，其基本原理是利用中药有效成分间的相互关系，只测定其中1个成分，再通过它们内部之间的关系来实现多个成分含量的同时评价。近年来一测多评法已在很多中药质量控制中得到应用，如梁洁萍等[9]采用HPLC法，以复方血栓通胶囊为研究对象，以人参皂苷Rg1为参比对照，建立了三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1的一测多评定量方法。耿燕娜等[10]同样建立了基于HPLC方法的，以人参皂苷Rb1为参比对照，针对复方丹参片中的三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1等主要皂苷类成分的一测多评定量方法。王超群等[11]系统考察了三七一测多评质量控制方法的可行性，并成功用于43个批次样品的检测。
本研究选取三七皂苷R1为参比对照品，建立了一种基于UPLC技术的快速准确、耐用性良好的一测多评(quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS)的方法，并将其运用到注射用血栓通(冻干)中5个主要皂苷的含量测定中，为降低该中成药的检测成本，提高检测效率提供参考依据。
1 仪器与试药Waters公司ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器；Waters公司BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)；上海沪西分析仪器厂XW-80A型涡旋混合器；Sigma公司3K15型高速离心机；Mettler Toledo公司AX 205型电子分析天平(十万分之一)，Sartorius公司BP121S型电子分析天平(万分之一)。
乙腈、甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水(Millipore纯水器生产)，其他试剂均为分析纯。对照品三七皂苷R1(批号110745-200617) 及人参皂苷Rg1(批号110703-201027)、Re(批号110754-200822)、Rb1(批号110704-201122)、Rd(批号111818-201001) 购自中国食品药品检定研究院；注射用血栓通(冻干)6个批次(批号分别为12080409、12080605、12090910、12100907、12102603、12113307)，成分为三七总皂苷，每支150 mg。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：Waters BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0~5 min，19% B；5~10 min，19%~20% B；10~16 min，20%~35% B；16~20 min，35%~37% B)；流速：0.5 mL·min-1；检测波长：203 nm：样品室温度：15 ℃；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。色谱图见图 1。
|
1.三七皂苷R1(notoginsenoside R1) 2.人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1) 3.人参皂苷Re(ginsenoside Re) 4.人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1) 5.人参皂苷Rd(ginsenoside Rd) 图 1 50%甲醇(A)、混合对照品(B)及样品(C)的UPLC色谱图 Figure 1 UPLC chromatograms of 50% MeOH(A), reference substances(B)and sample(C) |
精密称取不同批次的注射用血栓通(冻干)样品0.5 g，置于10 mL量瓶中，用50%甲醇溶液超声(功率300 W，频率40 kHz)溶解，放冷，再加至刻度线，混匀，即得供试品储备液；取储备液1 mL，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，即得供试品溶液，进样前14 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样。
2.3 混合对照品溶液的制备分别精密称取三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的对照品2.4、8.4、0.96、3.6、0.24 mg，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，涡旋混匀，即得混合对照品溶液Ⅰ；精密量取混合对照品溶液Ⅰ 600 μL，加50%甲醇200 μL稀释，得混合对照品溶液Ⅱ；精密量取混合对照品溶液Ⅰ 500 μL，加50%甲醇500 μL稀释，得混合对照品溶液Ⅲ；精密量取混合对照品溶液Ⅱ 500 μL，加50%甲醇500 μL稀释，得混合对照品溶液Ⅳ；精密量取混合对照品溶液Ⅲ 500 μL，加50%甲醇500 μL稀释，得混合对照品溶液Ⅴ；精密量取混合对照品溶液Ⅳ 500 μL，加50%甲醇500 μL稀释，得混合对照品溶液Ⅵ；精密量取混合对照品溶液Ⅴ 500 μL，加50%甲醇500 μL稀释，得混合对照品溶液Ⅶ；精密量取混合对照品溶液Ⅶ 500 μL，加50%甲醇500 μL稀释，得混合对照品溶液Ⅷ。
2.4 线性关系考察分别吸取“2.3”项下的8个混合对照品溶液，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液，按“2.1”项下的色谱条件，按浓度从低到高取溶液进样测定，记录色谱峰的面积。以对照品溶液进样浓度(mg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程(表 1)。结果显示，各成分标准曲线在线性范围内线性良好。
|
表 1 5个皂苷成分的线性关系和范围 Table 1 Regression equations and linear ranges of five saponins |
按“2.1”项下色谱条件，取“2.3”项下的8个混合对照品溶液分别进样测定各待测成分的峰面积，根据公式fr=(Ws×Ai)/(Wi×As)分别计算人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的相对校正因子(表 2)，式中fr、As、Ws、Ai、Wi分别为相对校正因子、内参物的色谱峰面积及其质量浓度(mg·mL-1)、待测成分的峰面积及其浓度(mg·mL-1)[12]。
|
|
表 2 样品中待测成分的相对校正因子 Table 2 RCFs of target compounds in sample |
取混合对照品溶液Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ，记为高、中、低3个浓度，每个浓度精密吸取10 μL，连续自动进样6针，记录三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的峰面积，得日内精密度；日间精密度以同样方法连续进样3 d(每隔12 h进样1次，每天2次)，其结果见表 3。
|
|
表 3 5个皂苷成分的精密度(n=6) Table 3 Precisions of five major saponins |
精密吸取同一供试品溶液(样品批号12090910)10 μL，分别在室温下(未避光，湿度约30%)放置0、3、6、9、12、24、48 h后进样分析，记录峰面积，三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd峰面积的RSD(n=7) 分别为0.94%、1.0%、0.99%、1.0%、2.5%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.8 重复性试验按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液(样品批号12090910)，按“2.1”项下色谱条件进样10 μL测定，记录峰面积，计算各待测物含量。结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd平均含量分别为10.78%、42.69%、5.47%、23.10%、1.03%，RSD分别为2.0%、1.8%、2.0%、1.7%、1.7%，结果表明实验重复性良好。
2.9 加样回收率试验精密称取已知含量的样品(批号12090910) 约0.25 g共9份，分别按低(80%)、中(100%)、高(120%)3个水平精密加入三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd对照品，按“2.2”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，其结果三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的平均加样回收率分别为100.2%、99.3%、100.5%、98.3%、100.6%，RSD分别为2.4%、2.3%、2.5%、2.2%、2.2%。
2.10 样品测定分别精密吸取按“2.2”项下方法制备好的供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定。分别采用外标法和一测多评法计算样品中待测成分含量，结果见表 4。
|
|
表 4 一测多评法与外标法测得的样品中5个皂苷的含量(%) Table 4 Contents of five saponins in sample by external standards and QAMS methods |
对外标法和一测多评法计算得到的含量进行比较，经t检验，p>0.05，表明2种方法所测得各成分含量不存在显著性差异，由此说明该一测多评法可用于注射用血栓通(冻干)中5个主要皂苷的含量测定。
3 讨论 3.1 校正因子的系统适用性 3.1.1 不同色谱温度对相对校正因子的影响取“2.3”项下混合对照品溶液Ⅴ，分别在30、35、40 ℃按照“2.1”项下色谱条件测定，连续进样3针，计算三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的相对校正因子，比较不同温度对相对校正因子的影响，结果各待测物相对校正因子的RSD < 1%，表明相对校正因子对不同柱温的耐用性良好。
3.1.2 不同进样体积对相对校正因子的影响取“2.3”项下混合对照品溶液Ⅴ，分别进样5、8、10 μL，按照“2.1”项的色谱条件测定，连续进样3针，计算三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的相对校正因子，比较不同进样体积对相对校正因子的影响，结果各待测物相对校正因子的RSD < 1.5%，表明不同进样体积对相对校正因子影响较小。
3.1.3 不同流速对相对校正因子的影响取“2.3”项下混合对照品溶液Ⅴ，分别为以0.4、0.45、0.5 mL·min-1的流速，按照“2.1”项的色谱条件测定，连续进样3针，计算方法计算三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的相对校正因子，比较不同流速对相对校正因子的影响，结果各待测物相对校正因子的RSD < 1%，表明不同流速对相对校正因子无显著性差异。
3.1.4 不同仪器对相对校正因子的影响取“2.3”项下混合对照品溶液Ⅴ，按照“2.1”项的色谱条件测定，连续进样3针，用不同仪器及不同类型色谱柱考察相对校正因子的重现性，其结果见表 5，表明相对校正因子对不同仪器、不同类型色谱柱的耐用性良好。
|
|
表 5 不同仪器、色谱柱测得的相对校正因子 Table 5 RCFs determined by different instruments and columns |
从色谱图可以看出三七皂苷R1分离度良好，无其他干扰峰，含量处于5个待测成分的中间位置，故选用三七皂苷R1作为参比对照。
本实验考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-磷酸-水3种流动相体系对注射用血栓通(冻干)的分离效果，结果显示乙腈系统分离效果较好，但乙腈-磷酸-水系统检测器基线漂移严重，最终选择了乙腈-水系统。
4 结论本实验建立了一测多评法用于测定注射用血栓通(冻干)样品中的5种主要皂苷类成分，该方法在6批样品中相对校正因子的含量计算值与外标法所测的实际值没有明显差异，表明该方法准确度高、耐用性好，在缺少对照品的情况下，可实现对注射用血栓通(冻干)制剂的多成分含量同时测定。中药具有多成份、多靶点的特点，传统中药成份定量方法，一般选取多个对照品，采用外标法进行含量测定，然而中药对照品大多比较昂贵，而且有些还常常有供不应求的现象，因此，增加含量测定指标无疑会增加检测成本；而一测多评法只采用1个对照品即可实现对多个成分的含量测定，显然降低的分析成本[13]。本实验采用了UPLC的方法[14-15]，该方法具有分离速度快，分离效率高，溶剂使用少，废液产生少等优点，可进一步节约经济成本，同时还节省了时间，加强了环保。
| [1] |
王忠全, 丁卓玲. 血栓通的临床应用研究进展[J]. 中国药业, 2007, 16(11): 62. WANG ZQ, DING ZL. The clinical application research progress of thrombosis[J]. China Pharm, 2007, 16(11): 62. DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2007.11.048 |
| [2] |
李芳芳, 李冬冬, 单远, 等. 注射用血栓通临床辅助应用研究进展[J]. 中成药, 2015, 37(3): 618. LI FF, LI DD, SHAN Y, et al. Research progress of clinical application of thrombus for injection[J]. Chin Tradit Pat Med, 2015, 37(3): 618. |
| [3] |
WANG LL, HAN LF, YU HS, et al. Analysis of the constituents in "Zhusheyong Xueshuan Tong" by ultra high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry combined with preparative high performance liquid chromatography[J]. Molecules, 2015, 20(11): 20518. |
| [4] |
CHEN M, YANG WZ, WU WY, et al. Chemical Analysis of Xueshuantong lyophilized powder by LC-MS profiling[J]. Chin Herb Med, 2015, 7(1): 54. DOI:10.1016/S1674-6384(15)60020-X |
| [5] |
YAO CL, YANG WZ, ZHANG JX, et al. UHPLC-Q-TOF-MSbased metabolomics approach to compare the saponin compositions of Xueshuantong injection and Xuesaitong injection[J]. J Sep Sci, 2017, 40(4): 834. DOI:10.1002/jssc.201601122 |
| [6] |
YANG WZ, ZHANG JX, YAO CL, et al. Method development and application of offline two-dimensional liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry-fast data directed analysis for comprehensive characterization of the saponins from Xueshuantong injection[J]. J Pharm Biomed Anal, 2016, 128: 322. DOI:10.1016/j.jpba.2016.05.035 |
| [7] |
WANG M, ZHANG HJ, DONG RR, et al. Compatible stability study of panax notoginseng saponin injection(Xueshuantong R)in combination with 47 different injectables[J]. Biomed Chromatogr, 2016, 30(10): 1599. DOI:10.1002/bmc.v30.10 |
| [8] |
王智民, 高慧敏, 付雪涛, 等. "一测多评"法中药质量评价模式方法学研究[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(23): 1925. WANG ZM, GAO HM, FU XT, et al. Multi-components quantitation by one marker new method for quality evaluation of Chinese herbal medicine[J]. China J Chin Mater Med, 2006, 31(23): 1925. DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2006.23.001 |
| [9] |
梁洁萍, 陈思, 谢称石, 等. 复方血栓通胶囊中4个有效成分的一测多评定量方法研究[J]. 中山大学学报(自然科学版), 2013, 52(5): 123. LIANG JP, CHEN S, XIE CS, et al. A quantitative method using one marker for simultaneous assay of four effective components in compound Xueshuantong capsule[J]. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni, 2013, 52(5): 123. |
| [10] |
耿燕娜, 张文鑫. 一测多评法同时测定复方丹参片中人参皂苷Rg1, Re, Rb1和三七皂苷R1含量[J]. 中国实验方剂学杂志, 2015, 21(1): 69. GENG YN, ZHANG WX. Simultaneous quantitative determination of ginsenosides Re, Rg1, Rb1 and notoginsenoside R1 in Fufang Danshen tablets by QAMS[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2015, 21(1): 69. |
| [11] |
王超群, 贾秀虹, 陈季, 等. 中药三七"一测多评"质量控制方法的系统研究[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(22): 3438. WANG CQ, JIA XH, CHEN J, et al. Systematic study on QAMS method for quality control of Panax notoginseng[J]. China J Chin Mater Med, 2012, 37(22): 3438. |
| [12] |
王智民, 钱忠直, 张启伟, 等. 一测多评法建立的技术指南[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(6): 657. WANG ZM, QIAN ZZ, ZHANG QW, et al. Establish technical guide for establish QAMS method[J]. China J Chin Mater Med, 2011, 36(6): 657. |
| [13] |
沈小钟, 刘瑶, 杨燕军, 等. 一测多评法研究进展[J]. 中国药业, 2013, 22(13): 1. SHEN XZ, LIU Y, YANG YJ, et al. Research advances in quantitative analysis of multi-components by single-maker[J]. China Pharm, 2013, 22(13): 1. DOI:10.3969/j.issn.1006-4931.2013.13.001 |
| [14] |
单玲玲, 靳光乾, 刘善新. UPLC、RRLC及UFLC在中药质量控制中的研究进展[J]. 中华中医药杂志, 2011, 26(10): 2340. SHAN LL, JIN GQ, LIU SX. Research progress of quality control on Chinese traditional medicine by UPLC/RRLC/UFLC[J]. China J Tradit Chin Med Pharm, 2011, 26(10): 2340. |
| [15] |
陈佳, 王钢力, 姚令文, 等. 超高效液相色谱(UPLC)在药物分析领域中的应用[J]. 药物分析杂志, 2008, 28(11): 1976. CHEN J, WANG GL, YAO LW, et al. Recent applications of ultra performance liquid chromatography(UPLC)in pharmaceutical analysis[J]. Chin J Pharm Anal, 2008, 28(11): 1976. |