清肺抑火片是由黄芩、栀子、黄柏、大黄等9味中药组成，收载于《卫生部药品标准》第二册(WS₃-B-0418-90)^[1]。具有清肺止嗽、降火生津功效，是常用的中成药。处方中君臣佐使^[2]分别为黄芩、栀子、黄柏和大黄。在中国药典2015年版一部^[3]中黄芩的含量测定项目为测定黄芩苷含量；栀子的含量测定项目为测定栀子苷含量；黄柏的含量测定项目为测定小糪碱的含量；大黄的含量测定项目为测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚的含量。清肺抑火片能够发挥药效，主要是由于处方中的各味中药及中药中的有效成分的相互协同作用的结果。现行的药品质量标准中没有鉴别项目和含量测定项目，不能对制剂的质量进行有效控制。经文献检索，李建等^[4]、张小慧等^[5]、李应芬等^[6]作者对现行质量标准进行了改进；康绍建等用HPLC-DAD法同时测定清肺抑火片中栀子苷、黄芩苷、大黄素和大黄酚4个成分含量^[7]；赵子剑等用HPLC法测定清肺抑火片中栀子苷、大黄素和大黄酚的含量^[8]；汪霞用RP-HPLC法同时测定清肺抑火片中大黄3种成分的含量^[9]；康绍建等用HPLC-DAD法同时测定清肺抑火片中苦参2种成分^[10]；马志英用高效液相色谱-双波长紫外检测同时测定清肺抑火片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小糪碱及大黄素4种有效成分的含量^[11]；李海霞等用毛细管电泳-电喷雾电离质谱法同时测定清肺抑火片中苦参碱、药根碱、氧化苦参碱、栀子苷4种药效成分的含量^[12]；林瑞群等^[13]、张义友等^[14]、马春云^[15]、蒋兰英等^[16]、李海泉等^[17]、李晓梅等^[18]分别用HPLC法测定清肺抑火片中1种药效成分；李玉仿^[19]对清肺抑火片进行了薄层分析研究；周浓等^[20]用高效液相色谱法测定不同厂家清肺抑火片中黄芩苷的含量。，然而建立的方法只是反映处方中部分药材的质量情况。中药复方的药效发挥是多组分协同作用的结果，各有效成分的含量及其比例均会影响其药效。本项研究建立了处方中的君臣佐使，即黄芩、栀子、黄柏和大黄4味中药，按照2015年版中国药典一部^[2]中该4味中药规定的含量测定项目8个有效成分黄芩苷、栀子苷、小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的高效液相色谱分析方法，为控制清肺抑火片的质量提供了可行有效的方法。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司)；Agilent Eclipse Plus C₁₈(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Agilent公司)；B5500S-MT型超声波清洗器(Branson公司)。

对照品栀子苷(批号110749-201316，含量97.5%)、黄芩苷(批号110715-2014016，含量94.0%)、盐酸小檗碱(批号110713-200911，含量86.8%)、芦荟大黄素(批号110798-201007，含量98.0%)、大黄酸(批号110757-200910，含量99.5%)、大黄素(批号110756-200110，含量98.7%)、大黄酚(批号110796-201017，含量99.6%)、大黄素甲醚(批号110758-201616，含量99.0%)均购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯，水为超纯化水，其他试剂均为分析纯。清肺抑火片，每片重0.6 g，由云南省曲靖药业有限公司生产，批号151202、160501、150610。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Agilent Eclipse Plus C₁₈(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱(0~18 min，90% B→77%B；18~30 min，77%B→73%B；30~35 min，73%B→65%B；35~40 min，65%B；40~45 min，65%B→35%B；45~58 min，35%B；58~65 min，35%B~90%B；65~70 min，90%B)，流速为1.0 mL·min^-1，柱温30 ℃，检测波长为254 nm，进样量10 μL。

2.2 溶液制备 2.2.1 混合对照品储备液

分别精密称取栀子苷对照品49.05 mg，黄芩苷对照品15.41 mg，盐酸小檗碱对照品9.35 mg，芦荟大黄素对照品9.98 mg，大黄酸对照品7.07 mg，大黄素对照品10.85 mg，大黄酚对照品9.49 mg和大黄素甲醚对照品15.20 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成含栀子苷0.478 2 mg·mL^-1，黄芩苷0.144 9 mg·mL^-1，盐酸小檗碱0.081 2 mg·mL^-1，芦荟大黄素0.097 80 mg·mL^-1，大黄酸0.070 35 mg·mL^-1，大黄素0.107 1 mg·mL^-1，大黄酚0.094 52 mg·mL^-1，大黄素甲醚0.150 5 mg·mL^-1的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液

将清肺抑火片研细，称取1.0 g置具塞碘量瓶中，精密加甲醇20 mL，称量，超声(超声功率250 W，频率40 kHz)处理30 min，，置水浴上回流30 min，放冷，称量，用甲醇补足减失的量，静置，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液

按处方分别制备不含栀子、黄芩的阴性样品、不含黄柏的阴性样品以及不含大黄的阴性样品；按“2.2.2”项下方法分别制备各阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取混合对照品溶液、供试品溶液及各阴性样品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下，注入HPLC仪测定，记录色谱图(图 1)。本实验条件下，供试品溶液与对照品溶液对应的吸收峰的理论塔板数均大于5 000，对应的色谱峰的分离度均大于1.5。阴性样品溶液的图谱显示清肺抑火片中其他成分对8个分析物的测定无干扰(图 1)。

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品储备液1、2、5、10、15、20 mL，分别置100 mL量瓶中，加甲醇制成系列浓度对照品溶液。分别注入HPLC仪，记录峰面积，以峰面积Y为纵坐标，对应的对照品的浓度X(μg·mL^-1)为横坐标，进行线性回归，得回归方程，相关系数(r)及线性范围，见表 1。

2.5 精密度试验及检测限、定量限测定

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。1 d内重复6次，测定各对照品峰面积，计算日内精密度，所得栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.82%、0.61%、0.064%、0.53%、0.041%、0.72%、0.18%、0.13%；连续进样3 d，每天进样1次，测定各对照品峰面积，计算日间精密度，所得上述待测成分峰面积的RSD分别为0.66%、0.29%、0.32%、1.2%、0.57%、1.0%、0.65%、1.7%。结果说明精密度良好。

取混合对照储备溶液逐级稀释，进行测定，色谱峰以信噪比为3:1及10:1时各对照品的浓度分别确定为该方法的检测限和定量限。结果见表 1。

2.6 重复性试验

取清肺抑火片样品(批号160501)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，进样10 μL，测得8个分析物的峰面积。所得栀子苷、黄芩苷、小檗碱(盐酸小檗碱计)、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚平均含量分别为分别为0.801、0.307、0.050、0.119、0.178 mg·g^-1、0.115、0.270、0.066 mg·g^-1，RSD分别为1.5%、1.8%、2.1%、1.9%、1.1%、1.7%、1.4%、1.1%。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，在常温下，分别在制备后0、2、4、6、8、12和24 h，在“2.1”项色谱条件下进样测定8个分析物的峰面积。所得栀子苷、黄芩苷、小檗碱、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.63%、0.85%、0.49%、0.32%、0.28%、0.95%、0.66%、0.73%，表明供试品溶液在常温下24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量样品约0.5 g，共9份，平均分为3组，按低、中、高浓度分别加入混合对照品储备液各0.8、1.0、1.2 mL，按照“2.2.2”项下方法制备溶液，进样10 μL进行测定，结果见表 2。

2.9 样品含量测定

取3批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样分析，以外标法计算样品中8个分析物含量，结果见表 3。

3 讨论 3.1 提取方法的选择

精密称取同1批号样品3份，分别用70%甲醇水室温浸渍12 h、索氏提取12 h、超声提取30 min。经实验考察，索氏提取与超声提取效果好，8个分析物的含量均高于室温浸渍，故选择超声提取法。

3.2 提取条件的选择

精密称取同1批号样品3份，考察了超声提取30 min再水浴回流15 min、超声提取30 min再水浴回流30 min，超声提取30 min再水浴回流1 h，结果超声提取30 min再水浴回流1 h方法和超声提取30 min再水浴回流30 min提取方法的提取效率相同，而高于超声提取30 min再水浴回流15 mn，故选择超声提取再水浴回流30 min。

3.3 提取溶剂的选择

精密称取同一批号样品6份，分别用纯水、50%甲醇水、70%甲醇水、甲醇、50%乙醇水、95%乙醇水、三氯甲烷，经实验考察甲醇提取的效果最好，8个分析物的含量均高于其他溶剂提取，故选择甲醇为提取溶剂。

3.4 提取时间的确定

精密称取同1批号样品3份，以甲醇为提取溶剂，分别超声提取15、30、60 min，结果30 min与60 min提取结果基本一致，故超声提取30 min时基本提取完全。

3.5 流动相的选择

在实验中比较了甲醇-水、甲醇-磷酸水、甲醇-甲酸水、甲醇-乙酸水、甲醇-乙腈-乙酸水、乙腈-磷酸水等流动相系统，最终选用乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，以梯度洗脱法将待测物与杂质组分完全分离，并取得较好峰形和较高的理论塔板数，效果满意。

3.6 检测波长的选择

芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚最大吸收波长为254 nm，栀子苷的最大吸收波长在238 nm，黄芩苷的最大吸收波长在280 nm附近，小檗碱的最大吸收波长在270 nm附近，栀子苷、黄芩苷和小檗碱在254 nm处均有良好的紫外吸收，采用254 nm作为测定波长监测8个有效成分均能达到方法学考察的要求，考虑到同一波长下测定使得方法更加简单，增加了普适性，所以黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚选择254 nm作为检测波长。

本法一次性测定清肺抑火片中的8个有效成分，可以对制剂的质量进行较为系统全面的控制，操作简捷，流动相选用经济，单波长即可同时检测8个成分，便于方法推广。