2017, Vol. 37 
健脾益肾丸是基于“五脏相关学说”理论，结合治疗慢性肾衰竭20余年的临床经验总结制成的中药制剂[1-2]。该方由黄芪、酒苁蓉、丹参、炙甘草、白术、山药、豆蔻及大黄8味药组成，具有健脾益肾、活血化浊之功，主治慢性肾功能衰竭脾肾阳气虚，兼有湿浊、水气和瘀毒等症。方中重用黄芪益气健脾升阳运枢为君，酒苁蓉温肾扶阳、润肠通便为臣，丹参活血祛瘀为佐，炙甘草健脾而调和诸药。现代研究显示，黄芪的有效成分为黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷[3-5]、酒苁蓉的指标成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷[6-8]、丹参的指标成分为丹参素钠和丹酚酸B[9-11]及炙甘草的指标成分为甘草苷和芒柄花素[12-13]，本文采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS法)，在同一条件下对以上8个成分进行测定，并进行了系统的方法学考察，可为的制剂质量控制研究提供可行性的手段。
1 仪器与试药 1.1 仪器LC-20AT型高效液相色谱仪、LC-2020型质谱仪、LC solution色谱工作站(岛津公司)；Agilent ZORBAX C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；安捷伦公司)；Sartorius BP 211D型电子天平(十万分之一，Sartorius公司)；CQ-250L-DST型超声波清洗机(上海跃进医用光学器械厂)；TGL-21M型高速冷冻离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)。
1.2 药材、药品及试剂健脾益肾丸(深圳市中医院制剂科，批号20151221、20151222、20151223)；对照品丹参素钠(批号110855-201412，纯度大于98%)、丹酚酸B(批号为111562-201514，纯度大于98%)、松果菊苷(批号111670-201505，纯度大于98%)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号为111920-201505，纯度大于98%)、甘草苷(批号为111610-201607，纯度大于98%)、毛蕊花糖苷(批号110757-200206，纯度大于98%)、黄芪甲苷(批号为110781-200613，纯度大于98%)和芒柄花素(批号为111703-201504，纯度大于98%)均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Agilent ZORBAX C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-10 mmol·L-1乙酸铵溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0~1.2 min，5%A；1.2~2 min，5%A→20%A；2~4 min，20%A→40%A；4~8 min，40%A；8~10 min，40%A→95%A；10~17 min，95%A；17~25 min，5%A)，流速为0.8 mL·min-1，进样量5 μL。
2.2 质谱条件采用电喷雾离子化源(ESI)，检测电压3.5 kV；雾化器压力为241 kPa；干燥气为N2，流速为1.5L·min-1；离子喷雾温度为350 ℃。正负离子方式同时检测，扫描方式为选择离子监测(SIM)，用于定量分析的监测离子为丹参素m/z 196.95[M-H]-、丹酚酸B m/z 717.05[M-H]-、松果菊苷m/z 785.10[M-H]-、毛蕊异黄酮酮葡萄糖苷m/z 481.00[M+Cl]-、甘草苷m/z 417.00[M-H]-、毛蕊花糖苷m/z 623.10[M-H]-、黄芪甲苷m/z 807.40[M+Na]+和芒柄花素m/z 266.95[M-H]-；橙皮苷为内标，监测离子为m/z 609.15[M-H]-。
2.3 溶液制备 2.3.1 内标溶液称取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含100 μg的溶液，即得。
2.3.2 对照品储备液分别取丹参素钠、丹酚酸B、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、甘草苷、黄芪甲苷和芒柄花素的对照品适量，精密称定，加甲醇制成含丹参素钠10 μg·mL-1，丹酚酸B 2 μg·mL-1，松果菊苷20 μg·mL-1，毛蕊异黄酮葡萄糖苷20 μg·mL-1，毛蕊花糖苷2 μg·mL-1，甘草苷2 μg·mL-1，黄芪甲苷5 μg·mL-1，芒柄花素0.2μg·mL-1的单一成分溶液，即得。
2.3.3 供试品溶液取样品粉末0.1 g，精密称定，置于50 mL离心管中，加入甲醇40 mL，超声(250 W，40 kHz)30 min，放置室温，混匀，滤过，精密吸取续滤液4 mL及内标溶液0.5 mL于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3.4 阴性样品溶液按健脾益肾丸处方比例以及制备工艺制得不含黄芪、酒苁蓉、丹参及炙甘草的阴性样品，按“2.3.3”项下操作方法制得阴性样品溶液。
2.4 专属性试验取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各5 μL，在上述色谱质谱条件下进行测定。结果样品色谱图中在与对照品色谱图相同的保留时间处有相应的色谱峰；而阴性样品色谱图中未见相应色谱峰，表明样品测定无干扰，其选择离子流图见图 1。
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图 1 阴性样品(A)、混合对照品(B)及样品(C)选择离子流图 Figure 1 SIM chromatograms of negative sample(A), mixed reference substances(B)and sample(C) |
精密吸取各对照品储备液和内标溶液适量，加甲醇逐级稀释，分别制得各待测物质量浓度在0.003~20 μg·mL-1 7个浓度的混合对照品溶液(内标质量浓度10 μg·mL-1)，按上述色谱-质谱条件测得峰面积，并以待测物质峰面积与内标峰面积比值为纵坐标(Y)，各物质质量浓度为横坐标(X，μg·mL-1)绘制标准曲线并进行线性回归计算，得相应的标准曲线回归方程，结果表明各成分在相应的线性范围内线性关系良好。同时，以峰面积为噪音3倍(S/N=3) 和10倍(S/N=10) 的进样浓度为检测限和定量限，结果见表 1。
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表 1 线性关系考察、检测限及定量限测定结果 Table 1 Results of linear, LOD and LOQ |
精密量取“2.5”项下的混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积并计算其RSD。结果丹参素、丹酚酸B、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、甘草苷、黄芪甲苷和芒柄花素的RSD(n=6) 分别为1.2%、1.6%、1.7%、2.2%、1.5%、2.0%、1.3%和1.9%，表明该仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验取供试品溶液(样品批号20151221)，分别于0、2、4、6、8、24 h进样测定，记录峰面积。结果丹参素、丹酚酸B、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、甘草苷、黄芪甲苷和芒柄花素峰面积的RSD分别为1.5%、2.4%、1.6%、1.2%、2.0%、1.7%、2.1%和1.8%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验取同批样品(批号20151221)6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进行测定，记录峰面积并计算样品含量。结果丹参素、丹酚酸B、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、甘草苷、黄芪甲苷和芒柄花素平均含量(n=6) 分别为493.2、1 812.4、506.8、681.6、615.2、110、56、22 μg·g-1，RSD分别为1.0%、1.5%、1.4%、1.9%、1.3%、1.4%、2.1%和1.6%，表明该方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验取已知含量的样品(批号20151221) 约0.05 g，共6份，精密称定，分别加入混合对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算回收率，结果见表 2，表明本方法加样回收率良好。
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表 2 回收率试验结果(n=6) Table 2 Results of recovery |
取3批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进行测定，根据内标法计算样品中各成分的含量，结果见表 3。
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表 3 样品中8个成分的含量(mg·g-1，n=3) Table 3 Contents of eight components in samples |
在前期的条件摸索中，尝试采用HPLC-DAD法对健脾益肾丸中的有效成分进行含量测定，发现黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和酒苁蓉中的毛蕊花糖苷等成分相互干扰未能达到完全分离，且黄芪中的黄芪甲苷在紫外检测器上没有吸收；而HPLC-MS法具有选择性好和灵敏度高，并且不要求被测成分完全分离，这对于分析相对复杂的中药复方制剂具有较强的优势[14]，故选用液质联用法对健脾益肾丸中的有效成分含量进行同时测定。此外，测定过程中采用内标法，进一步提高了测定的精密度和准确度。相比于多反应监测模式(MRM)，本研究采用的SIM模式专属性较低，使得样品选择离子流图中某些测定成分出现多个色谱峰。为解决这一问题，试验过程中通过借助紫外检测器定位测定成分色谱峰的保留时间，弥补了这一不足。
3.2 质谱条件的优化在对各被测成分的质谱参数进行优化中发现，黄芪甲苷在正离子检测模式下响应较好，且易产生加合离子峰[M+Na]+，故以m/z 807.4作为离子[15]。其他7个成分在负离子模式下的响应高于正离子模式，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的负离子检测模式下易产生加合离子峰[M+Cl]-，故以m/z 481.00作为离子。综合以上情况，确定选择正负离子模式同时对健脾益肾丸中8个主要成分进行检测。此外，本研究选择和大多数被测样品成分有相似响应的内标物质，采用内标法计算进一步提高测定的精密度和准确度。
3.3 色谱条件的考察本试验对乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-乙酸铵水溶液、乙腈-氨水溶液等流动相体系进行了考察。结果表明，采用乙腈-乙酸铵水溶液作为流动相时，样品中各成分的色谱峰分离较好，且检测灵敏度较高。因此，最终选用乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵水溶液作为本实验的流动相。在提取方法的选择中发现，超声和回流提取的效果相当，因此选用较为简便的超声提取方法。此外，在不同提取溶剂考察中选用了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇水和甲醇，结果表明甲醇的提取率较高，故选择甲醇作为提取溶剂。
综上，本试验建立同时测定丹参素钠、丹酚酸B、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、甘草苷、黄芪甲苷和芒柄花素含量的方法，该方法快速、准确、高效、灵敏，可作为该药内在化学指标成分含量测定的质控手段。
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