2017, Vol. 37 
漏芦花为菊科漏芦属植物祁州漏芦Rhaponticum uniflorum (L.) DC.的干燥花序，国内分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、内蒙古等地。祁州漏芦根入中药，具有清热解毒、消痈、下乳、舒筋通脉的功效[1]。祁州漏芦花入蒙药，是蒙医习用常用药材，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)，蒙药名为洪古尔-珠尔，具有“杀粘”、清热、解毒、理气、止痛等功效，主治感冒、心热痢疾、血热及传染性热症等[2-3]。漏芦花在蒙药单方、复方中常用，在内蒙古地区野外资源较为丰富，药品市场也有流通，但目前尚缺少有效的质量评价方法[4-6]。有些研究仅对药材中某个成分进行检测，单一成分质量控制难以反映临床功效。蒙药与中药一样，应以“多成分、多靶点、多效应”描绘其物质内涵与作用特点，单一指标的控制不能保证产品质量的均一性和有效性。
文献报道[7]及本课题组前期的研究[8]表明漏芦花主要的次生代谢产物为黄酮、木脂素以及甾酮等类化合物，其中甾酮也是中药漏芦的指标性成分[9-11]。指纹图谱研究亦表明漏芦花中含量较高的化合物是以槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素、芹菜素和5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮为代表的黄酮类化合物。蜕皮甾酮是菊科漏芦属和麻花头属植物普遍含有的特征性生理活性成分[12-14]；泥胡木脂素B葡萄糖苷作为新化合物，仅从菊科药用植物泥胡菜中分离得到过[15]。这些化合物色谱峰图形好，分离度好，可作为漏芦花的指标性成分。本研究建立了HPLC法同时测定漏芦花药材中这6种成分含量的方法，以期为漏芦花的质量控制和资源的可持续开发利用提供技术支撑。
1 仪器与试药UltiMate 3000型高效液相色谱仪(Thermo Fisher，chameleon色谱工作站)；YMC-Pack C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；YMC公司)；AB-135S分析天平(十万分之一，瑞士梅特勒-托利多仪器厂)；AL240分析天平(万分之一，瑞士梅特勒-托利多仪器厂)；KQ-500DE超声仪(昆山市超声仪器厂)。
漏芦花药材共计8个批次，为采集或购自内蒙古各地药材公司、医院，所有样品经内蒙古医科大学王素巍讲师鉴定为祁州漏芦Rhaponticum uniflorum(L.)DC.的干燥花序。对照品木犀草素(批号YY90108)、芹菜素(批号YY90113) 和蜕皮甾酮(批号YY90217) 均购于上海源叶生物试剂公司，纯度>98%，供含量测定用；泥胡木脂素B葡萄糖苷、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮和槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷为实验室自制，经MS，1H-和13C-NMR确定结构，HPLC峰面积归一化法测得纯度均>98%。乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品母液精密称取槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素、芹菜素、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、蜕皮甾酮和泥胡木脂素B葡萄糖苷的对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.800、0.994、1.000、0.501、1.998、0.961 mg·mL-1的单一对照品储备液。分别取上述各对照品溶液7、3、2.5、1、2.5、6 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品母液，置于4 ℃的冰箱中保存。
2.1.2 供试品溶液取漏芦花粉末(过4号筛)约0.2 g，精密称定，精密加入60%乙醇溶液25 mL，称量，超声(功率500 W，频率40 kHz)提取30 min，放冷，再次称量，用60%乙醇溶液补足减失的量，摇匀，滤过，取滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2 色谱条件采用YMC-Pack C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)，柱温35 ℃，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0~15 min，20%A→25%A；15~50 min，25%A→40%A)，流速0.8 mL·min-1，检测波长254 nm，进样量10 μL，在该色谱条件下各组分分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10 000，色谱见图 1。
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1.蜕皮甾酮(ecdysterone) 2.槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(quer-cetin-3-O-α-L-rhamnoside) 3.泥胡木脂素B葡萄糖苷(hemislin B glucoside)4.木犀草素(luteolin) 5.芹菜素(apigenin) 6. 5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮(5，7，4′-trihydroxy-3′-methoxyflavone) 图 1 混合对照品(A)和3号样品(B)的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and sample No. 3(B) |
精密吸取“2.1.1”项下混合对照品母液0.4、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，甲醇定容，即得系列混合对照品溶液。精密吸取上述不同浓度的混合对照品溶液及混合对照品母液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。以峰面积Y为纵坐标，溶液浓度X为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，线性方程、r和线性范围见表 1。
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表 1 线性关系考察结果 Table 1 Results of linear relation |
取3号漏芦花药材粉末，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积；结果槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素、芹菜素、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、蜕皮甾酮和泥胡木脂素B葡萄糖苷峰面积的RSD分别为0.41%、1.2%、1.4%、2.2%、0.59%、1.2%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取3号漏芦花药材粉末，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，分别于溶液制备后的0、2、4、6、8、12、24 h内进样测定；结果槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素、芹菜素、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、蜕皮甾酮和泥胡木脂素B葡萄糖苷峰面积的RSD分别为0.74%、1.8%、1.6%、2.6%、0.72%、1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.4 重复性试验取3号漏芦花药材粉末6份，按“2.1.2”方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，测得槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素、芹菜素、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、蜕皮甾酮和泥胡木脂素B葡萄糖苷的平均含量分别为1.10%、0.38%、0.11%、0.04%、0.32%、0.42%，RSD分别为1.3%、2.0%、2.1%、2.8%、3.0%、2.7%，表明该方法重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验取已知含量的3号漏芦花粉末约0.1 g，共9份，精密称定，分别精密加入相当于药材中6个待测成分含量的80%、100%、120%倍量的对照品溶液，平行3份，按“2.1.2”方法制备供试溶液，进样测定，计算各成分的加样回收率及RSD，结果见表 2，表明该方法准确度良好。
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表 2 加样回收率试验结果 Table 2 Results of recovery rate test |
分别称取不同批次的漏芦花干燥粉末约0.2 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，用回归方程计算6个成分的含量，结果见表 3。
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表 3 样品含量测定结果(%，n=3) Table 3 The results of sample determination |
对不同的提取方法(回流提取和超声提取)、提取时间(20、30、40、60、50、90 min)、提取溶剂(水，30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇溶液，甲醇；30%乙醇、50%乙醇、55%乙醇、60%乙醇、65%乙醇、70%乙醇、95%乙醇溶液)及取样量(0.1、0.15、0.2 g)进行考察，最终确定取样量为0.2 g，加60%乙醇溶液25 mL，超声提取30 min为最佳提取条件。
3.2 色谱条件的优化对不同流动相，流动相比例分析比较，确定以乙腈-0.2%磷酸水为流动相较为合适；采用二极管阵列检测器在210~400 nm范围内扫描混合对照品溶液中各成分的紫外吸收，最终选择254 nm为检测波长。
3.3 小结本研究建立了HPLC法同时测定蒙药漏芦花中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素、芹菜素、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、蜕皮甾酮和泥胡木脂素B葡萄糖苷6个指标性成分的含量测定方法，并对野外采集实验室阴干的药材样品以及收集于药材市场和蒙中医院的药材样品进行了检测。8批漏芦花样品中槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、木犀草素、芹菜素、5，7，4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、蜕皮甾酮和泥胡木脂素B葡萄糖苷的含量分别在0.66%~1.26%、0.19%~0.60%、0.08%~0.24%、0.03%~0.05%、0.31%~0.99%、0.42%~2.26%之间。本研究建立的方法快捷、准确，可望为漏芦花药材的质量评价和有效控制提供科学依据。
| [1] |
中国药典2015年版. 一部[S]. 2015: 370 ChP 2015. Vol Ⅰ[S]. 2015:370 |
| [2] |
国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草(蒙药卷)[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1999, 400. Editorial Committee of Chinese Materia Medica, State Administration of Traditional Chinese Medicine. Chinese Materia Medica (Mongolian Medicine Volume)[M]. Shanghai: Shanghai Science and Technology Publishers, 1999, 400. |
| [3] |
国家药品标准. 蒙药分册[S]. 1998: 54 National Drug Standards. Mongolian Medicine Volume[S]. 1998:54 |
| [4] |
杨美珍, 王晓琴, 刘勇, 等. 祁州漏芦化学成分与药理活性研究[J]. 中成药, 2015, 37(3): 611. YANG MZ, WANG XQ, LIU Y, et al. Studies on the chemical constituents and pharmacological activities of Rhaponticum uniflorum[J]. Chin Tradit Pat Med, 2015, 37(3): 611. |
| [5] |
康大伟, 董赫男, 许良, 等. 漏芦花中生物碱类化合物含量测定及抗氧化性研究[J]. 分子科学学报, 2015, 31(3): 229. KANG DW, DONG HN, XU L, et al. Study of alkaloids in the Rhaponticum uniflorum and its antioxidational effects[J]. J Mol Sci, 2015, 31(3): 229. |
| [6] |
吴吉英, 白玉霞, 斯日棍其其格. 蒙药漏芦花中黄酮类化合物的研究[J]. 天然产物研究与开发, 2014, 26(8): 1225. WU JY, BAI YX, SIRGQQG. Study on flavanoids of Rhaponticum uniflorum[J]. Nat Prod Res Dev, 2014, 26(8): 1225. |
| [7] |
包小妹, 刘乐乐, 罗素琴, 等. 蒙药漏芦花的化学成分研究[J]. 中华中医药杂志, 2012, 27(7): 1914. BAO XM, LIU LL, LUO SQ, et al. Studies on chemical constituents of the flower of Rhaponticum uniflorum[J]. China J Tradit Chin Med Pharm, 2012, 27(7): 1914. |
| [8] |
杜月, 王晓琴, 包保全, 等. 祁州漏芦花化学成分研究[J]. 中草药, 2016, 47(16): 2817. DU Y, WANG XQ, BAO BQ, et al. Chemical constituents from flowers of Rhaponticum uniflorum[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2016, 47(16): 2817. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2016.16.006 |
| [9] |
LI XQ, WANG JH, WANG SX, et al. A new phytoecdysone from the roots of Rhaponticum uniflorum[J]. J Asian Nat Prod Res, 2000, 2(3): 225. |
| [10] |
ZHANG YH, LI XP, LU ZG, et al. A new ecdysteroid from Rhaponticum uniflorum[J]. Chin Chem Lett, 2001, 12(9): 797. |
| [11] |
ZHANG YH, WANG HQ. Ecdysteroids from Rhaponticum uniflorum[J]. Pharmazie, 2001, 56(10): 828. |
| [12] |
杨秀伟. 麻花头属和漏芦属药用植物中蜕皮甾酮类成分及其生物活性研究[J]. 中国现代中药, 2013, 15(11): 922. YANG XW. Study on ecdysteroids and their bioactivities of genus Serratula and Stemmacantha medicinal plants[J]. Mod Chin Med, 2013, 15(11): 922. |
| [13] |
程捷恺, 张永红, 张自义, 等. 祁州漏芦中蜕皮甾酮类化学成分的研究[J]. 高等学校化学学报, 2002, 23(11): 2084. CHENG JK, ZHANG YH, ZHANG ZY, et al. Studies on structure of ecdysterones from Rhaponticum uniflorum[J]. Chem J Chin Univ, 2002, 23(11): 2084. DOI:10.3321/j.issn:0251-0790.2002.11.011 |
| [14] |
果德安, 楼之岑, 高从元, 等. 祁州漏芦蜕皮甾酮类化学成分的研究[J]. 药学学报, 1991, 26(6): 442. GUO DA, LOU ZC, GAO CY, et al. Phytocedysteroids of Rhaponticum uniflorum root[J]. Acta Pharm Sin, 1991, 26(6): 442. |
| [15] |
REN YL, YANG JS. Hemislin B glucoside, a new lignan from Hemistepta lyrata[J]. Chin Chem Lett, 2002, 13(12): 859. |