2017, Vol. 37 
2. 辽宁华润本溪三药有限公司, 本溪 117004
2. China Resources Liaoning Benxi Third Pharmaceutical Co., Ltd., Benxi 117004, China
透骨草为豆科野豌豆属植物山野豌豆(Vicia amoena Fisch.)和狭山野豌豆(Vicia amoena Fisch. var. angusta Freyn.)的干燥地上部分。现被收载于《中国药典》2015年版四部附录[1]、《辽宁省中药材标准》[2]、《中药大辞典》[3]等，具有祛风除湿、活血止痛之功效，主要用于风湿疼痛、筋脉拘挛、阴囊湿疹、疮疡肿毒[4]等症，在我国北方应用广泛。目前透骨草的质量控制报道很少，且化学成分含量测定研究较为少见。本课题组对狭山野豌豆进行化学分离得到金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷，其中金丝桃苷[5]具有抗急性肝损伤、抗抑郁、抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌等作用；槲皮苷[6]可以抗肿瘤、抗抑郁、抗病毒、保护肝脏、保护心血管等；异槲皮苷[7]具有抗菌、抗氧化及抗神经炎等作用。本实验综合考虑被测组分的最大吸收波长[8-11]，采用HPLC法对狭山野豌豆与山野豌豆茎叶中金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷进行含量测定研究，以期为透骨草山野豌豆与狭山野豌豆药材质量标准的建立提供可靠依据。
1 仪器与材料岛津CTO-20AC高效液相色谱仪(岛津公司)；Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，北京迪马科技有限公司)；精密电子分析天平(赛多利斯仪器有限公司)；超纯水器(MILLIPORE公司)；万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；超声提取器(昆山市超声仪器有限公司)。
对照品金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷均为本实验室采用反复硅胶柱层析法分离药材狭山野豌豆制得，质量分数均≥98%。乙腈、磷酸、甲醇为色谱纯，实验用水为二次纯化水，其余试剂为分析纯。山野豌豆与狭山野豌豆茎叶均为本实验室采自于辽宁省(批号为SY150701、SY150705、SY150712、SY150912、SY150918、SY150922、XY150701、XY150705、XY150712、XY150912、XY150918、XY150922)，经辽宁省药品检验检测院中药室王维宁主任药师鉴定为豆科野豌豆属植物山野豌豆(Vicia amoena Fisch.)和狭山野豌豆(Vicia amoena Fisch. var. angusta Freyn.)；药材留样存放于辽宁省药品检验检测院中药标本室。
2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表 1；体积流量：1.0 mL·min-1；紫外检测波长：350 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，混合对照品溶液与供试品溶液中被测组分均能达到基线分离，峰形对称，分离度好，结果见图 1。
|
1.金丝桃苷(hyperoside) 2.异槲皮苷(isoquercitrin) 3.山柰苷(kaempferitrin) 4.槲皮苷(quercitrin) 5.山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷(kaempferol-3-O-α-L-arabinoside) 图 1 混合对照品(A)、山野豌豆供试样品(B)和狭山野豌豆供试样品(C) HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed standards (A). samples of Vicia amoena Fisch (B) and Vicia amoena var.angusta (C) |
|
表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program |
分别取金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷的对照品适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成混合溶液，即得(金丝桃苷756.00μg·mL-1，异槲皮苷746.00 μg·mL-1，山柰苷523.00μg·mL-1，槲皮苷1 442.00 μg·mL-1，山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷160.00 μg·mL-1)。
2.3 供试品溶液的制备 2.3.1 山野豌豆供试品溶液精密称取山野豌豆粉末(4号筛)2.5 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇溶液25 mL，超声(频率为40 kHz，功率为200 W)提取2次，每次30 min，合并提取液，滤过，滤液蒸至近干，残渣加水25 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，挥干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.3.2 狭山野豌豆供试品溶液精密称取狭山野豌豆粉末(4号筛)2.5 g，其余操作同“2.3.1”项，即得。
2.4 线性关系考察精密量取“2.2”项混合对照品溶液2.50、1.70、0.80、0.40、0.20、0.10 mL，分别置5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到6个不同浓度的系列混合对照品溶液；取上述不同浓度的混合对照品溶液分别过0.22 μm微孔滤膜，进样10 μL，进行色谱分析。以峰面积值(A)对质量浓度(C)进行线性回归，得金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷回归方程：
A=2.000 0×107C+2 565.5 r=0.999 9
A=2.000 0×107C-45 134 r=0.999 9
A=1.000 0×107C-30 734 r=0.999 9
A=2.000 0×107C+35 749 r=0.999 9
A=2.000 0××107C+2 512.8 r=0.999 9
线性范围分别为15.12~756.00、14.92~746.00、10.46~523.00、28.84~1 442.00、3.2~160.00 μg·mL-1。按照信噪比3︰1，金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷检测下限质量浓度分别为0.20、0.21、0.10、0.22、0.18 μg·mL-1。
2.5 精密度试验取金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖质量浓度分别为378.00、373.00、261.00、721.00、80.00 μg·mL-1的混合对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜，连续进样6次，结果金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷峰面积的RSD分别为0.21%、0.49%、0.31%、0.12%和0.11%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验取同一批山野豌豆(批号SY150701) 按“2.3.1”项方法处理后，分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，结果金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷峰面积的RSD分别为0.85%、0.62%、0.91%、0.25%和0.26%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
取同一批狭山野豌豆(批号XY150701) 按“2.3.2”项方法处理后，分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，结果金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷峰面积的RSD分别为0.71%、0.87%、0.82%、0.15%和0.23%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验取同一批山野豌豆(批号SY150701) 粉末按“2.3.1”项方法平行制备6份供试品溶液，进样10 μL。结果金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷平均含量分别为0.114、0.067、0.679、0.517、0.163 mg·g-1，RSD分别为1.4%、1.9%、1.3%、1.7%和1.2%。
取同一批狭山野豌豆(批号XY150701) 粉末按“2.3.2”项方法平行制备6份供试品溶液，进样10 μL。结果金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖平均含量分别为0.636、0.804、0.395、1.171、0.143 mg·g-1，RSD分别为1.6%、2.1%、1.6%、2.1%和1.7%。
2.8 加样回收率试验取同一批山野豌豆(批号SY150701) 粉末，精密称取1.25 g，平行6份，置具塞锥形瓶中，分别加入混合对照品溶液(分别取金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷的对照品适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成混合对照品溶液，其中金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷质量浓度分别为70.00、30.00、300.00、250.00、75.00μg·mL-1) 3 mL，按照“2.3.1”项方法处理后按“2.1”项色谱条件进样分析。结果金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷的平均回收率分别为102.3%、99.2%、98.9%、98.3%和99.5%，RSD < 1.6%。
取同一批狭山野豌豆(批号XY150701) 粉末，精密称取1.25 g，平行6份，置具塞锥形瓶中，分别加入混合对照品溶液(分别取对照品金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷适量，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成混合对照品溶液，其中金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷质量浓度分别为300.00、360.00、210.00、480.00、70.00 μg·mL-1)3 mL，按照“2.3.2”项方法处理后按“2.1”项色谱条件进样分析。结果金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷的平均回收率分别为101.9%、98.6%、100.1%、98.1%和99.8%，RSD < 1.5%。
2.9 样品测定取6批山野豌豆样品，分别按照“2.3.1”项方法处理，按“2.1”项色谱条件测定，采用外标法计算含量，结果见表 2。取6批狭山野豌豆样品，按照“2.3.2”项方法处理，按“2.1”项色谱条件测定，采用外标法计算含量，结果见表 3。
|
|
表 2 山野豌豆样品测定结果(mg·g-1，n=6) Table 2 The contents of analytes in Vicia amoena Fisch. |
|
|
表 3 狭叶山野豌豆样品测定结果(mg·g-1，n=6) Table 3 The contents of analytes in Vicia amoena Fisch. var. angusta Freyn. |
透骨草始载于明朝《救荒本草》(1406年)，具有祛风除湿，活血止痛之功能，用于风湿疼痛、痤疮肿毒等症[4]。在实际应用中透骨草来源复杂，《中国药典》2015年版四部附录(成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片)中将透骨草定义为我国北方地区使用的透骨草，即豆科植物山野豌豆V. amoena Fisch.、广布野豌豆V. cracca L.、假香野豌豆V. pseudo-orobus Fisch. et Mey.、毛山野豌豆V. amoena Fisch. var. sericea Kitag.和狭山野豌豆V. amoena Fisch. var. angusta Freyn.。因此，山野豌豆属透骨草被认为是透骨草药材应用的主流品种。狭山野豌豆为山野豌豆的变种，遗传相似性较高[12]，二者在内蒙古以及东北三省作为透骨草广为应用。本实验室对狭山野豌豆进行化学分离，得到的黄酮类化合物与山野豌豆类似[13]，因此，将研究对象确定为山野豌豆和狭山野豌豆。
本次试验同时考察了加热提取和超声提取2种方法，其二者提取的以上黄酮苷含量相近，同时，考虑到提取的方便，采用超声提取。试验结果表明狭山野豌豆中以槲皮苷含量最高，山野豌豆中以山柰苷含量最高，且狭山野豌豆中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷的含量均高于山野豌豆中所对应的含量。
采用超声提取，本试验对超声时间进行了考察，依次为10、20、30、40、50 min，发现30 min以后，所提取样品中金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷5个黄酮苷的量基本一致。鉴于节省试验时间与能源，将超声提取时间定为30 min。所用提取溶剂选择，通过40%~95%乙醇溶液提取并液相色谱检测，发现70%乙醇溶液提取物中黄酮苷量最多，但是色谱图中对照品峰附近有杂质峰干扰，因此，采用乙酸乙酯萃取方法，去除杂质峰。
通过对金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷进行紫外扫描得知，以上5个化合物均在212、260、350 nm处有吸收，经比较发现在350 nm处5个化合物均有较大吸收值，综合考虑将350 nm作为检测波长。同时，由于5个被测组分均为酚酸类化合物，分别尝试使用甲醇与冰醋酸、甲醇与磷酸、乙腈与冰醋酸、乙腈与磷酸作为流动相，且调节柱温以及使用不同型号的色谱柱[Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-Phenyl(200 mm×4.6 mm，5 μm)]筛选色谱条件，最后确定选用Diamonsil C18色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，柱温设定为25 ℃，在此条件下，5个被测组分可以完全达到基线分离。
通过对透骨草山野豌豆与狭山野豌豆的研究文献以及处方应用[14-18]查找发现：其处方在民间的使用较为广泛，但是对其质量控制标准报道较少。本实验室对山野豌豆与狭山野豌豆中的主要成分进行定量分析，建立的HPLC方法简单快速，灵敏度高，准确可靠，为其载入《中国药典》以及部颁标准奠定了基础。同时也为临床检测富含金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷及山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷的药材和制剂提供了良好的检测手段。
| [1] |
中国药典2015年版. 四部[S]. 2015: 422 ChP 2015. Vol Ⅳ[S]. 2015:422 |
| [2] |
李书心. 辽宁植物志[M]. 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 1988, 959. LI SX. Flora of Liaoning[M]. Shenyang: Liaoning Science and Technology Press, 1988, 959. |
| [3] |
江苏新医学院. 中药大辞典[M]. 上海: 上海人民出版社, 1979, 1878. Jiangsu New Medical College. Chinese Dictionary of Traditional Chinese Medicine[M]. Shanghai: Shanghai People's Press, 1979, 1878. |
| [4] |
蔡少青, 王璇, 李胜华, 等. 常用中药材品种整理和质量研究.第六册[M]. 北京: 北京大学医学出版社, 2003, 29. CAI SQ, WANG X, LI SH., et al. Species Systematization and Quality Used Chinese Traditional Drugs. Vol. 6[M]. Beijing: Peking University Medical Press, 2003, 29. |
| [5] |
李锦松, 陈剑鸿, 孟民杰. 金丝桃苷药理作用及其作用机制的研究进展[J]. 广东药学院学报, 2015, 31(2): 269. LI JS, CHEN JH, MENG MJ. Progress on the pharmacological effects and mechanism of hyperoside[J]. J Guangdong Pharm Univ, 2015, 31(2): 269. |
| [6] |
朱学鑫, 蒋福升, 丁志山. 槲皮苷生物活性的研究进展[J]. 蛇志, 2012, 24(1): 47. ZHU XX, JIANG FS, DING ZS. Research progress on the biological activity of quercetin[J]. J Snake, 2012, 24(1): 47. |
| [7] |
RIGANO D, FORMISANO C, BASILE A, et al. Antibacterial activity of flavonoids and phenylpropanoids from Marrubium globosum ssp. libanoticum[J]. Phytother Res, 2007, 21(4): 395. DOI:10.1002/(ISSN)1099-1573 |
| [8] |
黄宇, 兰莎, 张艺, 等. HPLC测定藏药樱草杜鹃中金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素的含量[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(14): 117. HUANG Y, LAN S, ZHANG Y, et al. Determination of hyperosid, quercetrin and quercetin in Rhododendron primulaeflorum by HPLC[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2013, 19(14): 117. |
| [9] |
袁丽春, 刘斌, 石任兵. HPLC法测定不同市售荷叶药材中金丝桃苷和异槲皮苷的含量[J]. 药物分析杂志, 2010, 30(1): 41. YUAN LC, LIU B, SHI RB. Determination of hyperosid and isoquercetrin in different market sale of lotus leaf by HPLC[J]. Chin J Pharm Anal, 2010, 30(1): 41. |
| [10] |
石秋梅, 邓翻云, 吴敏言. HPLC法同时测定新疆产2种罗布麻叶中芦丁、金丝桃苷及异槲皮苷的量[J]. 中草药, 2014, 45(9): 1326. SHI QM, DENG FY, WU MY. Simultaneous determination of rutin, hyperosid, and isoquercetrin in leaves of Apocynum venetum and Poacynum hendersonii located in Xinjiang by HPLC[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2014, 45(9): 1326. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2014.09.024 |
| [11] |
郁韵秋, 龚袆珈, 李端, 等. 高效液相色谱法同时测定罗布麻浸膏粉中金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素的含量[J]. 复旦大学自然科学版, 2007, 46(3): 417. YU YQ, GONG HJ, LI D, et al. Simultaneous determination of hyperosid, quercetrin and quercetin in extract of Apocynum by HPLC[J]. J Fudan Univ(Nat Sci), 2007, 46(3): 417. |
| [12] |
赵娜, 鲁萍, 李景欣. 东北地区野豌豆属四个种间遗传关系的ISSR分析[J]. 作物杂志, 2011(3): 93. ZHAO N, LU P, LI JX. ISSR analysis of genetic relationships among four species of Vicia L. in northeast China[J]. Crops, 2011(3): 93. |
| [13] |
魏锋, 阎文玫. 山野豌豆黄酮类化学成分的研究[J]. 药学学报, 1997, 32(10): 765. WEI F, YAN WM. Study on the chemical constituents of flavonoids from Vicia amoena Fisch[J]. Acta Pharm Sin, 1997, 32(10): 765. |
| [14] |
黄日一. 离子导入治疗腰腿痛78例报告[J]. 中医药学报, 1992(3): 20. HUANG RY. The report of 78 cases of iontophoresis in the treatment of lumbocrural pain[J]. J Tradit Chin Med, 1992(3): 20. |
| [15] |
黄中强, 叶宏伟, 叶建勋. 关节痛片治疗膝关节骨性关节炎90例疗效观察[J]. 新中医, 2002, 34(9): 23. HUANG ZQ, YE HW, YE JX. Curative effect observation of 90 cases of knee osteoarthritis treated by joint pain[J]. New Tradit Chin Med Sci, 2002, 34(9): 23. |
| [16] |
魏景梅. 推拿、熏洗法治疗肩周炎100例[J]. 河南中医, 1996, 16(6): 367. WEI JM. 100 cases of massage and fumigation in treating scapulohumeral periarthritis[J]. Henan Tradit Chin Med, 1996, 16(6): 367. |
| [17] |
李凤海. 中药熏蒸牵引治疗腰椎间盘突出症168例[J]. 中医外治杂志, 1995(2): 19. LI FH. 168 cases of treatment of lumbar intervertebral disc protrusion by fumigation with traditional Chinese medicine[J]. J Extern Ther Tradit Chin Med, 1995(2): 19. |
| [18] |
曹钒. 活络通利散熏洗配合功能锻炼治疗骨折病316例[J]. 浙江中医, 1996, 31(7): 324. CAO F. Fumigation of Huoluotonglisan combined with functional exercise in treatment of fracture disease in 316 cases[J]. Zhejiang Tradit Chin Med, 1996, 31(7): 324. |