2017, Vol. 37 
液相色谱法(liquid chromatography，LC)是目前最常用的分离手段，其中反相液相色谱法(reversed-phase liquid chromatography，RP-HPLC)广泛用于药物、食品、环境和生物样品等的分离中。市场上已有600多种不同品牌的反相色谱柱，且不断有新品牌出现。采用不同品牌、不同型号的色谱柱分析具体样品时，由于柱选择性的差异，溶质的保留值、色谱峰之间的分离度甚至色谱峰顺序都可能出现较大的差异[1-4]。因此，色谱柱选择是一件非常困难的工作，能否找到合适的色谱柱，关系到整个实验的成败。而各国药典包括中国药典、美国药典、欧洲药典等在描述RP-HPLC方法时，通常未规定色谱柱品牌、型号等具体信息，仅列出其基本信息，如中国药典中的“用十八烷基硅烷键合硅胶(C18柱)为填充剂”、美国药典中的“L1~L60填料”。欧洲药典中虽然有时还给出色谱柱孔径、颗粒大小、比表面积等信息，但这些物理参数与色谱柱选择性之间也仅有中度关联或缺乏关联[5]，使得实际工作中在选择色谱柱时依然存在一定的盲目性。因此，需要开发更优的能反映柱选择性的表征方法。
许多研究团队开展了反相色谱柱的表征工作，他们主要基于以下目的：(1) 采用简便的色谱方法评价反相色谱柱的性质，如分离效能、疏水性、硅醇基活性、离子交换能力、金属杂质含量和空间选择性；(2) 对不同品牌的色谱柱进行表征和分类。从20世纪70年代开始，研究者开始有意识地量化色谱柱的性质，并根据色谱柱的性质挑选色谱柱。这主要表现在对色谱柱填料类型、粒径、孔径、是否封尾、键和类型等物理参数进行描述，如根据色谱柱填料类型将色谱柱分为A型硅胶、B型硅胶和极性嵌入(embedded-polar-group columns，EPG)型色谱柱等。但这些指标过于笼统，与色谱柱的选择性缺乏关联，难以全面表征柱选择性的差异。21世纪初，通过对代表性溶质保留值的分析，采用不同的色谱柱参数和化学计量学方法，研究者逐渐建立起针对色谱选择性的柱表征体系[6-9]。利用色谱柱参数寻找相似或者不同的色谱柱，进而指导实际样品的分离，推动了柱选择模式的发展[10]。本文对近年来色谱柱表征体系的应用及局限性进行综述，主要包括选择相似或互补的色谱柱、选择最佳分离色谱柱、选择UHPLC色谱柱。
1 色谱柱表征体系色谱柱表征体系通过量化分析色谱柱中影响溶质保留行为的特征，对色谱柱进行分类，从而指导实际工作中色谱柱的选择。有效的色谱柱表征体系应具有以下特点：(1) 考虑了对色谱柱选择性有贡献的所有因素；(2) 每一个柱参数表征一种专属的溶质-色谱柱相互作用；(3) 能够得到大部分商业柱的色谱柱参数；(4) 对于特定色谱柱，不同实验室能够得到可重现的色谱柱参数；(5) 在特定实验条件下测定的色谱柱参数能应用到任何流动相或任何柱温下的分离[11]。
目前，国际上比较成熟的色谱柱表征体系有4个，分别是由Snyder、Euerby、Hoogmartens和USP色谱柱工作小组领导完成的[3-4]。其中，由Snyder等基于反相色谱保留机制提出的疏水消除模型(hydrophobic subtraction model，HSM)，理论基础较坚实，对色谱柱选择性的表征较全面，但其参数测定需要18种物质，方法相对复杂。其余3个体系的柱参数本质上并无区别，均取自代表性溶质的保留值，参数测定方法简便，但其对色谱柱性质的表征多基于经验。尽管不同表征体系中采用的色谱柱参数不同，却都可实现选择相似或者不同色谱柱的目的。4个表征体系采用的色谱柱参数及其所表征的色谱柱特性见表 1。
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表 1 色谱柱参数及其含义 Table 1 The column parameters used in each column characterization system and their meanings |
利用色谱柱参数对色谱柱进行表征和分类，可帮助分析人员从几百根色谱柱中挑选出选择性相似(equivalent columns)或不同的色谱柱(orthogonal columns)。4个体系中表示色谱柱相似性参数的计算方法均基于诸参数之间的欧氏距离(Euclidean distance，各参数差值平方和的平方根)，欧式距离越短，说明两根色谱柱的选择性越相似(表 2)。还有许多研究者利用不同的统计方法，如主成分分析[14]、聚类分析[14]、因子分析[15-16]，以处理后的柱参数间的欧式距离对色谱柱进行排序，从而筛选出相似或不同的色谱柱。
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表 2 表征色谱柱选择性的参数的计算方法 Table 2 Comparison of columns with the method of each column characterization system |
成熟的RP-HPLC检测方法如中国药典等质量标准中收载的方法通常需在不同的实验室、在较长的时间跨度内应用；由于新材料、新技术促使新型号的色谱柱不断涌现，老牌号的色谱柱逐渐退出市场；即使是相同品牌的色谱柱性质也可能随时间的推移而改变；因此选择和原始色谱柱选择性相似的替代柱是分析人员常面临的难题，特别是针对复杂样本分离系统，快速准确地找到选择性相似的色谱柱并非易事。
对于疏水消除模型，经过大量实验，通常认为当Fs小于3时，采用2根色谱柱的分离结果十分相似[17]。然而，Fan等发现，8种药物在Fs为9.7的2根色谱柱上的分离结果[9]基本一样，提示对于某些色谱系统，Fs小于3的标准可适当放宽，放宽程度取决于分离对象的复杂性以及对“相似”这一分离标准的认同程度。Fan等认为，两色谱柱的Fs若小于16，则选择性十分相似；若Fs小于35，则选择性相似；若Fs在35和55之间，则选择性有适度的区别；若Fs大于55，则选择性显著不同[9]。Johnson等采用系统选择性立方体(system selectivity cube，SSC)结合HSM的方法对500多根RP-HPLC柱进行了可视化表征，通过对2根色谱柱参数i/H(其中i=S，A，B，C)进行相关，当所得回归曲线的统计参数满足：r2>0.97，斜率=1.0±0.3，截距=0.00±0.03，且H1/H2 < 1.1，2根色谱柱的选择性就十分相似[18]。
2.2 选择互补的色谱柱相对于选择相似的色谱柱，选择互补色谱柱更加困难。互补色谱柱即选择性显著不同的色谱柱。在热调谐联用柱优化(thermally-tuned tandem-column optimization)中，不同温度下联用互补色谱柱，用来改善选择性[19]；互补色谱柱还常在二维液相色谱法中应用[20]。表 2中的色谱柱选择性参数的数值越大，表示2根色谱柱之间的选择性差异越大，即互补性越强。对不同类型的反相色谱柱的Fs进行分析，可以比较它们选择性的差异。例如，B型的C8柱和C18柱十分相似，它们的Fs通常小于6；而EPG柱和B型的C8或C18柱并没有显著差异(Fs约为15)；对于B型C18柱，要想最大化的获取不同选择性的互补柱，最好是选择氧化锆柱(Fs约为172) 或者氟取代烷基柱(Fs约为85)[17]。
疏水消除模型的建立者最初认为，Fs大于3的色谱柱之间具有不同的选择性[17]。最新的研究表明，当Fs大于55时，2根色谱柱才具有显著不同的选择性[9]。Johnson等提出的SSC方法中采用了色谱柱参数之间的相关性统计参数来表征柱之间选择性的差异，当满足：r2 < 0.20，斜率 < 0或>2，截距 < -0.3或>0.3，且H1/H2≥1时，2根色谱柱的选择性差异较大[18]。
对于难分离物质对，疏水消除模型中的溶质参数可为选择互补色谱柱提供参考，进而改善二者的分离。例如，如果1对难分离物质对的σ’值显著不同，可以选择柱参数S*差异较大的色谱柱作为互补色谱柱[17]。通常改变非离子型化合物的选择性要比离子型化合物困难很多。针对非离子型化合物的分离，可以省略表征离子交换作用的柱相似性参数Fs (-C)，当Fs大于100且Fs (-C)大于50时，非离子型化合物在互补色谱柱上分离开的可能性约为90%。如果结合流动相条件的改变(如有机相类型、柱温等)，实现非离子型化合物分离的可能性更大[21]。为此，分析人员可根据以下策略开发RP-HPLC的互补分离方法：(1) 根据Fs挑选选择性不同的色谱柱；(2) 改变有机调节剂的类型，例如若原始方法使用乙腈，可在互补方法中选用甲醇。通过上述两步，一般可显著改变α，使原始方法中的重叠峰得到有效分离[22]；(3) 如有必要，继续优化柱温、有机相比例或梯度变化速率[23]。对于离子型化合物，流动相pH也是引起选择性变化的重要因素。Zhang等对366根反相色谱柱(209根B型硅胶柱、58根A型硅胶柱、44根EPG柱、20根苯基柱、21根氰基柱、7根氟取代柱、3根氧化锆柱和4根特殊的聚合硅胶柱)的选择性进行评价，得到了一系列具有“极端”选择性的色谱柱，它们均不属于B型色谱柱。这些“极端”色谱柱可为选择RP-HPLC方法的互补色谱柱提供参考[24]。
2.3 局限性利用欧氏距离的模式选择色谱柱存在一定缺陷。针对疏水消除模型，Zhang等指出：① Fs基于柱参数的绝对值进行计算，而色谱柱的选择性主要取决于柱参数的相对差异；② Fs的计算通常采用全部的柱参数，而有研究表明某些难分离溶质对的分离仅和其中的1个或几个参数有关，因此Fs可能会误导色谱柱的选择；③ Fs是与参比色谱柱的柱参数比较得到的，当同时存在几根参比色谱柱(如欧洲药典对克拉霉素杂质的分离提供了3根适宜的色谱柱)时，很难与色谱柱库中的色谱柱同时进行比较[24]。这些缺陷在其他以欧氏距离表征色谱柱相似性的体系中同样存在。
为改善上述缺陷，许多研究者基于疏水消除模型进行了有益探索。Snyder研究小组提出了Fs的修正算法，依据溶质类型(如是否带有电荷)赋予色谱柱参数不同的权重系数[25]；Græsbøll等采用主成分分析法测定实现特定溶质分离的Fs的权重系数[20]；Zhang等基于疏水消除模型中的柱参数，利用相对色谱柱参数，通过建立选择性三角形来表征色谱柱的选择性[24]；Johnson等采用可视化的系统选择性立方体(SSC)直观地表征RP-HPLC柱的异同[18]。虽然这些研究改善了传统Fs的某些缺陷，但本质上仍属于通过比较色谱柱的相似性来选择色谱柱的模式。这种模式要求预先确定1根适合分离的最佳色谱柱为参比色谱柱，然而在实际工作中，往往很难确定最佳色谱柱。如果参比色谱柱不是最佳色谱柱，当出现其他色谱柱比参比色谱柱具有更好的分离效果时，可能会因为与参比色谱柱的相似性差别较大而错失。
3 选择最佳分离色谱柱RP-HPLC方法采用的色谱柱如果能使样品中的溶质都得到满意的分离，可按“2.1”项方法，寻找与该柱选择性相似的最优替代色谱柱。如果采用原始色谱柱分离样品时，难分离物质对无法实现满意分离，寻找最佳色谱柱及其参数范围将成为重要的命题。
3.1 方法近年来该领域的研究逐渐出现。2014年，Zhang等以疏水消除模型为基础，采用多元线性回归分析，探索了β-内酰胺类抗生素最佳色谱柱的参数范围，发现参数A是影响该类药物难分离物质对分离的关键柱参数，并提出了参数A的最佳区间[26]。2015年，Zuvela等以KUL色谱柱参数为基础，采用偏最小二乘法将KUL柱参数与分离效能参数(如保留时间、分离度或峰谷比)相关联，定性地分析了适合特定药物杂质分离的柱参数范围[27]。但上述寻找最佳色谱柱参数范围的探索属于定性或半定量分析，无法建立色谱柱参数与难分离物质对分离结果间的定量关系。而在众多的色谱柱表征体系中，疏水消除模型通过方程(1) 可将溶质对的分离(选择性因子α)和色谱柱参数直接关联。利用这一模型可选择相似或不同的色谱柱，如能够进一步建立溶质保留值与色谱柱参数的定量关系，还能预测溶质在不同色谱柱上的保留行为，进而筛选出最适宜分离的色谱柱。2016年，本课题组以克拉霉素杂质分析中难分离物质对的色谱柱选择为例，提出了应用上述原理选择最佳色谱柱的策略，取得一定进展[28]。
| $ \log \;{{\rm{\alpha }}_{12}} = \log (k/{k_{{\rm{ref}}}}) = \eta 'H + \sigma 'S + \beta 'A + \alpha 'B + \kappa 'C $ | (1) |
虽然疏水消除模型的准确性已经由不同类型的溶质在不同类型色谱柱的分离中得到了验证，但其是否适用于所有色谱条件下任何溶质的分离，还有待于进一步确证。如果基于疏水消除模型得到的模型的统计参数较差(如R2小于0.9，P值大于0.05)，可能很难利用该模型进行定量预测。
关于疏水消除模型在特定色谱条件下对特定溶质的适用性和准确性的研究已有诸多报道。Snyder等先后2次在相同的9根色谱柱上利用性质差别较大的两组溶质(n1=67，n2=33) 对模型的准确性进行了验证，α的误差均为0.9%(n1=603，n2=303)[22, 29]。随后又在87根B型色谱柱上利用这些溶质测定柱参数，在这87根色谱柱上的误差为1.2%(α，n=1392)[25]。在此基础上提出了仅采用其中的16个溶质测定色谱柱参数的方法[30]，并将疏水消除模型逐渐扩展到表征溶质在其他类型色谱柱上的分离。如A型(α的误差小于3%，38根色谱柱)[31]、EPG型(α的误差小于3%，21根色谱柱)[32]、氰基(α的误差为1%，11根色谱柱)[33]、苯基(α的误差为1%，11根色谱柱)色谱柱。但该模型对氟取代色谱柱、氧化锆键合色谱柱的误差较大(α的误差大于3%)，不过这可能与上述类型色谱柱的数量较少有关[34]。到目前为止，该模型已经测量了近600根色谱柱的参数，并可在以下网址http://apps.usp.org/app/USPNF/columns.html查询到。Snyder等注意到流动相pH改变会影响参数C的改变。除了pH外，有机相比例、柱温、有机相类型对大多数溶质在色谱柱log k的影响相似，特别是柱参数较为相似的2根色谱柱，因此，当比较2根相似色谱柱的选择性时，可认为色谱条件对色谱柱参数具有相同的影响。但当色谱条件与柱参数测定条件(50%乙腈/缓冲盐，pH 2.8，35 ℃)差别较大时，该结论的可靠性降低[29]。实际应用中，由于溶质结构更为多样，流动相组成也更加复杂。为探讨疏水消除模型的适用性，Fan等采用和色谱柱参数测试时相同的流动相，考察了疏水消除模型对18种阳离子药物溶质在14根性质差别较大色谱柱上的分离情况，扩展了该模型在阳离子药物中的应用(R2=0.974，S.E. (log k)=0.009)[9]。Zhang等利用疏水消除模型根据方程(2)，分析了8种β-内酰胺类抗生素中多个难分离物质对的分离情况(log α)，发现疏水消除模型可准确描述大部分溶质对的分离(R2>0.93，S.E. (log k)＜0.020)[26]。因此，采用疏水消除模型建立溶质分离参数与柱参数的定量关系，用以指导色谱柱的选择时，要注意考虑疏水消除模型的准确性，并需要有验证数据支持。
| $ \begin{array}{l} \log \;{\alpha _{12}} = (\eta {'_2}-\eta {'_1})H + (\sigma {'_2}-\sigma {'_1})S + (\beta {'_2}-\beta {'_1})A + \\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;(\alpha {'_2} - \alpha {'_1})B + (\kappa {'_2} - \kappa {'_1})C\\ \;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\; = \Delta \eta 'H + \Delta \sigma 'S + \Delta \beta 'A + \Delta \alpha 'B + \Delta \kappa 'C \end{array} $ | (2) |
近年来，超高压液相色谱法(ultra-high-pressure liquid chromatography，UHPLC)广泛应用于样品的快速分离。与常规的HPLC方法相比，UHPLC法的分析时间可减少3至10倍，且能获得更好的分离度、灵敏度和精密度[35-37]。
UHPLC方法的执行中通常伴随着方法转换，HPLC和UHPLC方法的转换主要有3类：(1) 在UHPLC仪器上直接使用HPLC方法；(2) 新开发的UHPLC方法转换成HPLC方法；(3) 将已有的HPLC方法转换成UHPLC方法，以减少分析时间[38]。鉴于色谱柱的选择性在实际分离中的重要性，实际转换中，为消除选择性的差异，选择相同的分离填料和流动相系统通常较易实现转换[39]。对于两方法间流动相和色谱柱尺寸的转换，通过比例缩放策略可简便实现[39-40]。而制约HPLC方法与UHPLC方法转换的一个重要因素是选择适宜的UHPLC色谱柱。自2005年诞生第1根商业UHPLC色谱柱以来[41]，出现了大量表面化学性质不同的亚2 μm杂化或硅胶颗粒固定相[42]。除反相分离模式外，商业的UHPLC柱已经涵盖亲水色谱[43]、正相色谱[44]、分子排阻色谱[45]和离子交换色谱[46]，而目前系统的UHPLC色谱柱选择策略还未见报道，仅部分反相UHPLC色谱柱利用疏水消除模型对其进行了量化表征，并采用和RP-HPLC柱相似的方法选择相似或者不同的色谱柱。然而目前应用于UHPLC的色谱填料类型与常规HPLC色谱柱填料相比较为单一，因此无法选择出与HPLC填料相似性一一对应的色谱柱。UHPLC分离时色谱柱粒径对选择性的影响可能比不同的填料类型的影响更大[47]，但配合流动相的调整，依然可以实现对难分离物质对的分离。这些使得建立通用的UHPLC色谱柱转换策略更加困难。如果能够在色谱系统中，根据最难分离物质对找出其分离度和色谱柱选择性参数、流动相之间的关系，并进行量化表征，即能较理想地解决UHPLC色谱系统的快速选择问题，进而加速UHPLC的应用。
5 结论反相色谱柱表征体系逐渐成熟，并且广泛地用于筛选色谱柱。但色谱柱表征体系针对特定样品中难分离物质对的分离，还有待细化。研究发现，结构类似溶质的分离只和部分关键色谱柱参数有关。因此，如何更好地研究难分离物质对分离与关键色谱柱参数的关系，并针对品种在液相色谱方法中规定关键柱参数的最佳范围，还需要研究者的不断探索。
反相色谱柱表征体系中的许多基本理论也可为其他类型色谱柱的表征提供借鉴，如UHPLC色谱柱[48]、亲水色谱柱[49]、超临界流体色谱柱[50]等，从而扩大对色谱柱的表征范围，便于该类色谱柱的应用。
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