2017, Vol. 37 
2. 宁波立华制药有限公司, 宁波 315174
2. Ningbo Lihua Pharmacy Co., Ltd., Ningbo 315174, China
在中药制药过程中，提取过程作为中药生产的特色环节之一，决定着中药中不同成分在成品中的比例，即决定着药品疗效。中药提取过程的质量控制仍是重要的课题，只对终端产品进行质检是不够的，需要更多地考虑工艺过程中的成分变化。如果生产工艺不能得到精确控制，会导致中药产品批次间质量差异较大，这也会影响中药国际化的推进。另外，制药过程缺乏快速检测手段，一般采用传统高效液相色谱法、紫外分光光度法等分析方法，步骤繁杂费时，信息反馈滞后，导致中药质量不稳定，有效成分含量低。因此寻找有效的，并能充分体现中药特色的快速质控手段就成为当务之急。发展从中药制药源头——提取工艺过程解决产品稳定性和可靠性问题的快速分析方法，对于中药工业技术进步和产品质量升级具有重大现实意义。
银杏叶具有益心、活血止痛、敛肺平喘之功效，是一种常用中药。总黄酮醇苷作为银杏叶中的主要成分，具有显著的药理、药效作用，因此，在银杏叶生产加工各工艺环节过程中常被用来作为质控指标。
近红外光谱（near-infrared spectroscopy，NIRS）分析技术是20世纪90年代发展起来的一项现代分析技术。它综合运用了计算机技术、光谱技术和化学计量等多个学科的最新研究成果，以其独特的高效、快速、成本低、环保，尤其是在线检测的突出优点，在农业、食品、石油化工和制药工程等学科中得到了广泛应用。在化学制药领域，NIRS已被运用于原料药质量分析[2]、反应过程[3]、制粒过程[4]、混合过程[5-6]、微波真空干燥过程[7]、压片过程[8]、包衣[9]和包装[10]过程，作为一种极有前途的过程分析技术[11]，其在中药生产领域也展现出了巨大的应用潜力[12-16]。
1 仪器、样品和对照品 1.1 仪器Waters2695高效液相色谱仪，Waters 2996检测器，Welch Ultimate XB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；月旭公司）；MPA傅立叶变换近红外光谱仪（德国BRUKER公司），测样装置为透射样品腔或透射光纤探头，TE-InGaAs检测器，光谱采集及信息处理软件为OPUS或Unscramber数据处理软件。
1.2 样品收集不同批次的银杏叶提取液、银杏叶解析液各24批，共48批提取过程液样本作为校正集用于近红外建模。宁波立华制药有限公司提供样品，具体信息见表 1。
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表 1 样品信息 Table 1 Sample information |
对照品槲皮素（批号10081-201108）、山柰素（批号110861-200907）、异鼠李素（批号110860-201011）购自中国食品药品检定研究院。
2 样本近红外透射光谱图的采集光谱采集条件：扫描范围12 500~4 000 cm-1，分辨率8 cm-1，扫描次数96次，每个样品测定2次，取平均光谱用于近红外建模。NIRS图见图 1。
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A. 1~12号银杏叶提取液（extraction of ginkgo leaf，No. 1-No.12）B. 1~12号银杏叶解析液（resolution solution of ginkgo leaf，No. 1-No.12） 图 1 样本的近红外透射光谱叠加图 Figure 1 Overlaid NIR transmission spectra of samples |
参考2015年版中国药典银杏叶项下总黄酮醇苷含量测定的高效液相色谱（HPLC）条件（以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50）为流动相，检测波长为360 nm；理论板数按槲皮素峰计算应不低于2 500），对校正集样本进行总黄酮醇苷的测定，以此作为建模参考值。
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1.槲皮素（quercetin）2.山柰素（kaempferide）3.异鼠李素（isorhamnetin） A.混合对照品（mixed reference substances）B.银杏叶提取液（extraction of ginkgo leaf） 图 2 校正集总黄酮醇苷测定HPLC图谱 Figure 2 HPLC chromatograms of total flavone glycosides in samples from the calibration set |
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表 2 总黄酮醇苷化学建模参考值的HPLC测定结果（mg·mL-1） Table 2 HPLC reference value for modelling of total flavone glycosides |
水分子所含的羟基，在近红外谱区的6 900 cm-1和5 180 cm-1附近有很强的倍频与合频吸收谱带，而其他各种物质分子的倍频与合频吸收相对较弱，因此水溶液物质体系中，水就成为NIRS分析时的强干扰因素。本项目在建模过程中避开水分的强干扰吸收波段进行建模，将RMSECV和r作为评价指标，通过对不同光谱区间进行建模试验（槲皮素，见表 3），最终选定总黄酮醇苷的最佳建模波段为“12 493.2~7 498.2 cm-1、6 101~5 446.2 cm-1”，从而避免了过多的冗余信息和干扰信息，改善了模型性能，提高了计算速度。此时RMSECV最小，r接近1，总黄酮醇苷的吸收特性在NIRS中得到了很好的体现。
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表 3 不同光谱波段的建模结果 Table 3 The modelling results of different spectral ranges |
在筛选出最佳建模波段和选定最佳光谱处理方法后，运用偏最小二乘法，通过内部留一交叉验证，建立了银杏叶提取液样本的NIRS和HPLC测定值之间的总黄酮醇苷定量校正模型。以该模型预测的校正集样本的总黄酮醇苷（槲皮素、山柰素和异鼠李素）含量与HPLC测得值之间的相关关系图见图 3。
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A.槲皮素（quercetin）B.山柰素（kaempferide）C.异鼠李素（isorhamnetin） 图 3 校正集样本中NIRS预测值与HPLC测定值之间的相关图 Figure 3 Correlation of the NIRS predicted value and the HPLC measured value in calibration set |
以含量未知的银杏叶提取液和银杏叶解析液样品各12批作为预测集，采集其NIRS，将其输入所建模型，即可快速得到其中总黄酮醇苷含量。该数据与HPLC参照方法测得值比较，结果见表 4及图 4。模型对银杏叶提取液和银杏叶解析液样品的预测效果以r和RMSECV衡量，r越接近1，同时RMSECV越小，模型的预测效果就越好。
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表 4 预测集样品HPLC及NIRS测定结果（mg·mL-1） Table 4 HPLC measured value and NIRS predicted value in validation set |
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A.檞皮素（quercetin）B.山柰素（kaempferide）C.异鼠李素（isorhamnetin） 图 4 验证集HPLC测定值与NIR预测值的比较 Figure 4 Comparison between HPLC measured value and NIRS predicted value in validation set |
由以上结果可以看出，所建立定量校正模型线性相关系数较高，模型预测值与HPLC测定值相差较小，此模型预测准确度较高。
7 结论本文提出了NIRS快速检测银杏叶提取液中总黄酮醇苷含量的方法，经研究表明，通过建立定量校正模型，NIRS可以对提取液中的黄酮醇苷含量进行准确测定。该方法无需样品前处理，与HPLC法相比，能节省大量人力、物力和时间，降低检测成本，为中药提取液实时检测提供了新的方法。
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