2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
重组DNA蛋白药物的质量控制[1]强调包括生产、工艺控制、原液和制剂在内的全过程控制。细胞基质残留是重组激素药物工艺相关杂质的重要组成部分[2]，包括宿主细胞残留蛋白、潜在的病毒及微生物、残留细胞DNA等。宿主细胞残留DNA关系到工艺稳定和产品安全性，残余宿主DNA分析是我国重组药物原料检定中强制要求的项目。由于原料中DNA残留量一般较低，所以在前处理过程中要降低药物蛋白对DNA提取效果的影响，提高提取效率，因而，其定量分析方法需有较好的样品前处理能力，较高的检测灵敏度和准确度。目前，不少重组激素药物宿主细胞残余DNA检测采用杂交法，如地高辛标记DNA杂交检测法、狭缝杂交——放射自显影等半定量方法[3]，其中，最灵敏的属放射自显影法，此方法一般可以检测到100 pg左右，而定量聚合酶链式反应（q-PCR）方法灵敏度可以达到fg级[4]。
重组人胰岛素通常是由酵母或E. coli细胞表达的重组激素类药物，中国药典三部2015年版规定E. coli细胞表达制品宿主DNA含量应不超过10 ng·剂量-1[5]。由于制剂无宿主DNA残留检测项目，所以，本文以某企业生产的E. coli表达的重组人胰岛素原料为研究对象，分别采用本实验室建立的蛋白酶K处理结合荧光定量PCR法和企业内控狭缝杂交-放射自显影法对残余DNA检测进行了对比研究。结果表明，荧光q-PCR法检测限更低，准确度更高，重复性更好，且操作简便、快速。
1 仪器和材料 1.1 主要仪器电子天平，梅特勒·托利多公司；干式加热器、7500实时定量PCR仪，Applied Biosystems公司；pH计，梅特勒·托利多公司；离心机，HealForce公司；MicroAmp®Optical 96-Well Reaction Plate，MicroAmp高透光，中度粘性耐高温覆膜，均为applied biosystems公司；TS435-L洗片机，岛津公司，Hoefer（48孔）狭缝点样器，安玛西亚公司。
1.2 样品3批重组人胰岛素原料药为本科室留样，为E. coli表达产品。
1.3 E. coli细胞染色体DNA标准品、探针、引物来自中国食品药品检定研究院（试剂盒正在协作标定，待上架到国家标准试剂盒）。
1.4 主要试剂染色体DNA浓度：100 ng·μL-1；探针浓度：100 pmol·μL-1；引物（F、R）浓度：100 pmol·μL-1；MasterPureTM纯化提取试剂盒：为核酸纯化提取试剂盒，含2×T & C裂解液、MPC蛋白沉淀剂，Illumia公司；无核酸酶水（DNA稀释液），Ambion公司；2×MIX（PCR Light Cycler 480 Probe Master）、蛋白酶K，罗氏公司；Glycogen，罗氏公司，用来配制70%乙醇溶液；Dig标记DNA检测试剂盒（10×封闭液、酶标抗体）、CDP-star（25 mmol·L-1）、高纯PCR模板制备试剂盒，罗氏公司；显影剂和定影剂，Foma Bohemia公司；预杂交液，TOYOBO公司。
2 方法 2.1 主要溶液配制TE（pH 8.0）缓冲液（300 mmol·L-1 Tris，25 mmol·L-1 EDTA）；70%乙醇溶液（含Glycogen 40 ng·mL-1）；0.2 mol·L-1 EDTA溶液（pH 8.0）；10% SDS；20×SSC；十二烷基肌酸钠溶液（10%）；马来酸缓冲液（pH 7.5）；洗膜液：含0.3%Tween 20的马来酸缓冲液；杂交液：预杂交液稀释变性DNA探针，质量浓度为0.2 μg·mL-1；底物缓冲液（pH 9.5，含1 mol·L-1氯化钠及0.1 mol·L-1 Tris-HCl）；抗体溶液（封闭液1:5 000稀释抗体）。
2.2 q-PCR方法测定DNA残留 2.2.1 供试品DNA的提取[6]用1×TE缓冲液150 μL溶解样品，在25 ℃下摇动孵化样品，直至溶解（约15 min），制备133.3 mg·mL-1溶液；加2×T & C细胞溶解液150 μL和蛋白酶K 1 μL，在65 ℃下涡流孵化15 min，每隔5 min振摇30 s；冰浴冷却5 min；加MPC蛋白沉淀试剂175 μL，彻底涡旋混匀；4 ℃下10 000 g离心10 min；将上清液转移至新的定量试管中，弃去沉淀；加冰冻异丙醇500 μL并缓慢用移液器吹吸混匀；4 ℃下10 000 g离心10 min；丢弃上清液，用70%乙醇冰冻液（含Glycogen 40 ng·mL-1）250 μL冲洗DNA沉淀并缓慢混合均匀；4 ℃下10 000 g离心10 min；弃去上清液，沉淀在空气中晾干；在60 ℃下用无菌无核酸酶水20 μL溶解分离的DNA 1 h；溶解后用于后续q-PCR的测定[7]。
2.2.2 q-PCR的检测采用水解探针，Taqman探针法对样品和E.coli染色体DNA含量测定用标准品进行定量PCR测定。将染色体DNA标准品用TE（pH 8.0）缓冲液稀释至2 250、450、90、18、3.6、0.72、0.14、0.03 pg·μL-1，即得系列标准品稀释液。采用PCR Light Cycler 480 Probe Master中的2×MIX和水，组成PCR体系[8]：上游引物0.16 μL，下游引物0.16 μL，探针0.16 μL，水（sterilized）4.52 μL，2×MIX10 μL，DNA模板5 μL。反应条件：预变性95 ℃ 10 min激活Taq酶；变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 s，循环45个；冷却40 ℃ 30 s。应用7500 software v 2.0.6进行数据分析，绘制标曲，将仪器读出的Ct值带入线性方程，计算出各批次品种的DNA残留量[9]。
2.2.3 q-PCR方法学考察 2.2.3.1 线性和范围按照“2.2.2”项中染色体DNA梯度稀释方法稀释，进行2次测定，确定线性和范围。
2.2.3.2 准确性及精密度验证随机取1批溶解好的样品溶液（制备方法见“2.2.1”项下方法）3次，各100 μL，分别加入450 pg·μL-1（高）、90 pg·μL-1（中）、18 pg·μL-1（低）的稀释后标准品溶液各10 μL，制备3个浓度加标样品，以DNA稀释液作为阴性对照，按照“2.2.1”项方法提取样品、加标样品、阴性对照的DNA，按照“2.2.2”项方法进行定量PCR扩增，平行做三复孔。应用7500 software v 2.0.6分析数据。按（加标样品测定值-样品测定值）/DNA标准品理论值×100%计算DNA回收率，验证方法的准确性。高、中、低浓度均测定3次，计算相对标准偏差（RSD），验证方法的精密度[10]。
2.3 狭缝杂交-放射自显影法测定DNA残留[11] 2.3.1 ST稀释配制用TE缓冲液（pH 8.0）对大肠杆菌DNA标准品100 ng·μL-1逐步稀释至200、20、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0 pg·μL-1，为ST1~ST10，每个梯度取50 μL，和样品及加标样品一同处理。
2.3.2 样品及加标样品配制样品：分别用40 mmol·L-1盐酸溶液溶解得到40 mg·mL-1浓度样品溶液，并分别加入Tris溶液60 μL稀释，混匀制得样品母液，3批样品浓度：01P为33.17 mg·mL-1，02P为34.20 mg·mL-1，03P为34 mg·mL-1。吸取30 μL上述样品母液即为1 mg低蛋白胰岛素样品S1；吸取150 μL上述样品母液即为5 mg高蛋白胰岛素样品S2。加标样品：吸取30 μL上述样品母液即为1 mg胰岛素，在30 μL样品母液中加入50 pg DNA（10 pg·μL-1）作为低蛋白加标样品S1P；吸取150 μL上述样品母液即为5 mg胰岛素，在150 μL样品母液中加入50 pg DNA（10 pg·μL-1）作为高蛋白加标样品S2P。
2.3.3 样品前处理对样品中残留DNA提取需进行样品前处理过程，而本过程需要添加2 mol·L-1乙酸钠（pH 4.1）等4种试剂进行处理，具体处理过程见表 1。
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表 1 样品处理体系配制 Table 1 The preparation of samples handling system |
将上述样品、加标样品、ST、空白配制混匀后，均加入到高纯过滤管中，8 000 g离心1 min，弃去上清液，加抑制剂清除液500 μL，8 000 g离心1 min，弃上清液，加冲洗缓冲液500 μL，8 000 g离心1 min，弃上清液，加冲洗缓冲液500 μL，8 000 g离心1 min，弃上清液，13 000 g离心10 min后，转移到新的eppendorf管中，并加洗脱缓冲液200 μL，8 000 g离心1 min，洗脱液即为上样样品DNA液（DNA制备所用试剂均来自高纯PCR模板制备试剂盒）。
2.3.4 点样及固定将处理后的ST、样品以及每批样品对应的加标样品，放在100 ℃变性10 min，迅速冷却后点样。点样后膜在80 ℃真空固定2 h；上样量：空白对照品C1和C5均为200 μL，各种样品均为200 μL。
2.3.5 预杂交将膜放入5 mL预杂交液中，封入杂交袋38 ℃预杂交4 h。
2.3.6 杂交将变性的探针加入后38 ℃杂交16 h。
2.3.7 洗涤加洗膜液（含0.3%的Tween 20的马来酸缓冲液）漂洗5 min，弃去。加封闭液，37 ℃水浴40 min，弃去。
2.3.8 酶标二抗加封闭液稀释的抗体溶液（1:5 000），37 ℃水浴40 min，弃去。加入洗膜液，室温浸洗2次，15 min·次-1。
2.3.9 暗室显影加上显影液，室温避光孵育30 min，放入洗片机，观察结果。
3 结果 3.1 定量PCR扩增结果标准曲线斜率为-3.39，截距为36.26，相关系数为0.982，扩增效率为97.16%。样品浓度与Ct值之间的线性关系表达：Ct=-3.39×log concentration+36.26。定量PCR扩增曲线光滑平稳，且指数增长期、线性增长期及平台期明显，符合定量检测要求[12]，如图 1。
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图 1 q-PCR扩增曲线 Figure 1 Amplification curve of q-PCR |
线性在0.03~2.25×103 pg·μL-1范围内线性良好。
3.2.2 准确性和精密度本次实验采用蛋白酶K结合q-PCR检测E. coli表达药品中宿主残留DNA的方法，对重组人胰岛素中残留DNA进行了3次测定，每次实验均对3个不同浓度的加标样品进行测定，均做三复孔，完成了该方法的初步验证。利用3次不同加标浓度的回收率平均值结果分析，均值差异系数（与实际值之间的差异）均 < 20%，可见该方法的准确性良好；通过对3次不同加标浓度的回收率相对标准偏差结果分析，RSD均 < 20%，可见该方法精密度较高。具体数据分析见表 2。
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表 2 不同加标量的DNA回收率 Table 2 Recovery of DNA in spiked samples of various concentrations |
采用蛋白酶K-荧光q-PCR法，检测重组人胰岛素中E.coli宿主DNA残留量，检测其可行性。测定结果见表 3。
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表 3 重组人胰岛素原料样品的DNA残留量检测结果 Table 3 The detected residual DNA results in recombinant human insulin samples |
利用狭缝杂交法对以上3批重组人胰岛素原料中残留DNA进行提取检测，采用X光片对检测结果进行结果观察，具体结果见图 2。由图 2可见，狭缝杂交-放射自显影法检测限最低为100 pg，而100 pg以下ST、样品、加标样品均无条带。
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图 2 自显影结果 Figure 2 The results of autoradiography |
目前重组人胰岛素原料质量控制中宿主DNA残留检测多采用杂交法[13]，杂交法试验周期长，操作复杂，影响因素多，试剂批次间不稳定，分析灵敏度低，不能准确定量，实际应用中重现性不好，失败率较高[14]。本研究中采用狭缝杂交-放射自显影方法测定，经多次试验，DNA浓度检测灵敏度仅能达到100 pg，而50 pg及以下均未显影，见图 2。而通过Taqman探针技术优化的E. coli细胞残留染色体DNA检测方法，检测限到0.1 pg。该方法与杂交法相比，实验步骤更加简单、灵敏度更高、重现性好，具有显著优势。
鉴于重组激素类药物原料[15]中DNA残留较低，工艺中间体成分复杂等问题，要准确定量测定，需要开发出操作简便，抗干扰能力强，回收率高的样品前处理方法。本研究利用蛋白酶K消化预处理、MasterPureTM纯化试剂盒纯化等步骤，很好地解决了样品前处理问题，使得回收率提高至近90%。研究结果表明，蛋白酶K消化结合荧光q-PCR法适用于重组人胰岛素原料E. coli细胞残留DNA检测。并且此方法不仅可用于激素类药物的放行检验，还可对激素类药物工艺过程中DNA去除的关键步骤进行评价，从而起到全程控制的作用。期望该文数据能够为将来开发灵敏度更高，周期更短，适用性更广的方法提供可靠的技术支持。
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