刺槐Robinia pseudoacacia L.为豆科蝶形花亚科刺槐属多年生落叶乔木，刺槐花涩，性平，有小毒，入肝经，收敛止血，止大肠下血，咯血，又治妇女红崩^[1]。洋槐蜜为蜜蜂科昆虫中华蜜蜂(Aips cerana Fabricius)或意大利蜜蜂(Aips mellifera ligustica Spinola)采集刺槐花蜜或分泌物，经过充分酿造而贮藏在巢脾内的甜物质。目前国内外主要采用UV法^[2-3]、HPLC法^[2-6]、LC-MS法^[7-11]、GC-MS法^[12-15]、IR法^[16-17]和NMR法^{[10, 17]}等研究洋槐蜜中的抗氧化成分、挥发性组分、抗生素残留以及掺假掺杂情况等。由于洋槐蜜是洋槐花蜜或分泌物经过意大利蜜蜂或中华蜜蜂的采集、储存和分泌等一系列过程产出的天然食品，从而导致了与洋槐花间既存在着密切的联系，又存在一定的区别。那么，能否通过同时分析洋槐花和洋槐蜜中的黄酮类成分来寻找洋槐蜜中的特征黄酮类组分呢？Giovanna等^[15]的研究思路(同时分析不同洋槐花部位的挥发性组分和洋槐蜜中的挥发性组分来研究洋槐蜜中挥发性组分的来源)给本次实验的设计提供了参考依据。本次实验主要采用UPLC-MS/MS法分析洋槐蜜、洋槐花不同部位以及洋槐花整花中的黄酮类化合物，寻找洋槐蜜中各黄酮类组分的来源，并将洋槐蜜与洋槐花中的共有成分作为特征组分的备选。

1 仪器与试药

液质联用仪由日本岛津LC-30AD型超高效液相系统和LCMS-8040型三重四极杆串联质谱仪组成，配有Nexera X2 LC-30AD二元高压梯度泵、SIL-30AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱、电喷雾离子源、PEAK氮气发生器和Lab Solution工作站；成都超纯科技有限公司UPT-Ⅱ-10T型制水器；梅特勒-托利多公司XS-205型电子天平；梅特勒-托利多公司ME1002E型电子天平；德国IKA RV10型旋转蒸发仪。

儿茶素(批号877-200001，纯度100%)、表儿茶素(批号110878-200102，纯度100%)、芦丁(批号100080-200707，纯度90.5%)、葛根素(批号0752-9907，纯度100%)、黄芩素(批号111595-200402，纯度100%)、木犀草素(批号111520-200504，纯度100%)、芹菜素(批号111901-201102，纯度99.6%)、染料木素(批号111704-201302，纯度99.1%)、高良姜素(批号111699-200501，纯度100%)、汉黄芩素(批号1514-200202，供鉴别用)均购于中国食品药品检定研究院，白杨素(批号00003620-001，仅供定性用)、槲皮素(批号00017030-566，纯度95.0%)、山柰酚(批号00011021-901，纯度97.7%)、生松素(批号00016840-158，仅供定性用)、杨梅素(批号00013921-524，纯度95.3%)、桑黄素(批号00013896-415，纯度91.0%)、柚皮素(批号00014205-603，纯度98.7%)购于ChromaDex，芸香柚皮苷(批号MUST-13041206，纯度98%)购于中国科学院成都生物研究所。超纯水，UPT-Ⅱ-10T型制水器当日制备，电阻率＞18 mΩ；D-101型净品大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

本文中所用蜂蜜分别由浙江千红蜂产业有限公司(简称千红)、浙江江山恒亮蜂产品有限公司(简称恒亮)和董家蜂农处分批购入。所用洋槐花由衢州市出入境检验检疫局徐国群提供，产地为浙江省江山市，经王笑笑鉴定为豆科刺槐属刺槐花，又称洋槐花，作为对照药材备用。另有玫瑰花蜜从市场上购买，用于蜂蜜的提取回收率和基质效应等方法学试验。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3(2.1 mm×75 mm，2 µm)；流动相：甲醇(A)-0.02%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0~5 min，2%A→15%A；5~10 min，15%A→17%A；10~15 min，17%A→32%A；15~30 min，32%A→42%A；30~40 min，42%A；40~45 min，42%A→50%A；45~50 min，50%A→65%A；50~55 min，65%A→70%A；55~56 min，70%A→2%A；56~58 min，2%A)；流速：0.4 mL·min^-1；柱温：40 ℃；进样量：2 µL。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)，雾化气流量3 L·min^-1，脱溶剂温度250 ℃，加热块温度400 ℃，载气流量15 L·min^-1；不同对照品的母离子质量数(Q1)m/z、子离子质量数(Q3)m/z、驻留时间(dwell time)、Q1 Pre Bias、碰撞电压(CE)和Q3 Pre Bias见表 1。

2.3 混合对照品的配制

分别精密称取儿茶素、表儿茶素、桑黄素和山柰酚的对照品8.35、5.62、4.42和16.68 mg置同一100 mL量瓶中；其余12种对照品分别以甲醇为溶剂，配制成一定浓度的单一成分对照品溶液，再分别精密量取1 mL置上述100 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，制成含儿茶素83.5 μg·mL^-1、表儿茶素56.2 μg·mL^-1、芸香柚皮苷4.76 μg·mL^-1、芦丁1.307 μg·mL^-1、桑黄素40.2 μg·mL^-1、杨梅素9.00 μg·mL^-1、柚皮素0.69 μg·mL^-1、槲皮素4.495 μg·mL^-1、染料木素4.055 μg·mL^-1、木犀草素3.665 μg·mL^-1、山柰酚163.0 μg·mL^-1、芹菜素1.072 μg·mL^-1、生松素1.18 μg·mL^-1、汉黄芩素0.353 μg·mL^-1、白杨素2.925 μg·mL^-1、高良姜素11.12μg·mL^-1的混合溶液，即得。

2.4 洋槐蜜的提取纯化

样品处理方法参考了相关文献[18-19]中蜂蜜的提取方法：取蜂蜜100 g，加入pH 2.0的盐酸500 mL，搅拌溶解后用盐酸调节pH至2.0，再加入已处理好的D-101型大孔吸附树脂(粒度范围0.3~1.2 mm)150 g，搅拌10 min，装柱，用酸水(盐酸调节pH至2.0的水溶液)250 mL和蒸馏水300 mL先后冲洗柱子除去糖及其他组分，再用甲醇400 mL以1~2滴·s^-1的流速解吸附，收集甲醇，40 ℃低温旋转蒸干；最后用蒸馏水10 mL溶解，水溶液用乙醚(10、10、10 mL)提取纯化3次，合并乙醚液，水浴蒸干，甲醇溶解至10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，用微孔滤膜(0.22 µm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。供试品的总离子流(TIC)色谱图见图 1。

2.5 洋槐花的提取

首先，将一部分洋槐花的花瓣与其他部位(花托，花蕊，蜜腺和花萼等)进行分离；再将各部位与整花自然阴干，其提取方法结合Martos等^[18]和李艳艳等^[20]的方法：取自然阴干的样本2.0 g，粉碎过2号筛，加入pH 2的盐酸水溶液80 mL，加热提取1 h，放冷，滤过，滤液加入D-101型大孔吸附树脂150 g，搅拌10 min，装柱，先用蒸馏水300 mL冲洗柱子，再用甲醇400 mL以1~2滴·s^-1的流速解吸附，收集甲醇，40 ℃低温旋转蒸干，最后用甲醇溶解至10 mL量瓶中并定容，即得。

2.6 方法学考察

本次实验方法学的考察内容主要有：最低检测限、最低定量限、线性、精密度、稳定性、蜂蜜的提取回收率和基质效应等，考察结果具体参照王笑笑等的研究报道^[21]。

2.7 样本测定

按照“2.4”和“2.5”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件分别进样2 µL，以外标法计算各黄酮类组分含量，结果见表 2。

3 讨论 3.1 液质色谱条件的优化

本法参照Escriche等^[22]、Yao等^[23]和郭夏丽等^[2]使用甲醇-甲酸作为流动相，考察了梯度洗脱程序和正、负离子扫描方式下各被测成分的响应强度和碎片离子数。通过对多种梯度洗脱程序的比较，最后在流动相比例上参考了郭夏丽等使用的方法，在时间上有所调整和延长。通过考察发现，被测组分的离子响应强度正离子模式高于负离子模式10~100倍，但是其碎片离子数多(除汉黄芩素外)且不稳定，故采用负离子模式为主，此结果与黄酮类化合物有较多羟基，呈酸性易失去氢离子形成稳定的氧负离子，而汉黄芩素因8-OH被甲氧基取代从而能形成较为稳定的正离子有关，这与单鸣秋的研究结果^[24]一致。因甲酸在水溶液中易电离出正离子，与氧负离子重新结合成分子，从而影响离子响应强度，故本实验分析比较了不同甲酸浓度下各被测组分的离子响应强度，发现低浓度甲酸溶液具有较高的离子响应强度，当甲酸浓度为0.02%时其离子响应强度达到最大，高于0.05%时，其离子响应强度趋向平稳，并随着甲酸浓度的增大而逐渐降低。故以0.02%甲酸溶液作为流动相B。

3.2 混合对照品溶液配制的优化

在对各黄酮类化合物的最低检出限初步考察时发现，儿茶素、表儿茶素、桑黄素和山柰酚4种化合物的灵敏度偏低，最低检出限浓度均较高，而柚皮素、槲皮素和汉黄芩素等的灵敏度较高，其他适中。故在配制混合对照品溶液时，将此4种化合物均采取一步稀释，而其他化合物根据取样情况分别进行稀释。最后测得4种化合物的最低检出限分别为0.334、0.224、0.804和1.63 μg·mL^-1，是其他化合物的10~1 800倍。

3.3 洋槐蜜与洋槐花检测结果比较

从表 2可以看出：洋槐蜜与洋槐花中同时存在柚皮素、槲皮素、染料木素、木犀草素、山柰酚、芹菜素和汉黄芩素，将这7种黄酮类化合物进行含量占比分析发现，各组分在洋槐蜜和洋槐花中的占比相似，分别为5.75：23.21：5.00：30.37：32.47：2.94：0.25和2.45：23.05：0.88：5.41：66.04：2.13：0.03。洋槐花酸水提取中未检出生松素、白杨素和高良姜素，其中高良姜素非极性较强，在酸水溶液中溶解性差，在乙醇等极性溶剂中溶解性强，故采用酸水提取的洋槐花中未检出高良姜素；洋槐花瓣中的黄酮类化合物含量除了山柰酚和汉黄芩素均低于其他结构1个数量级；洋槐花瓣中未检出染料木素和木犀草素，这2种化合物主要存在于雄蕊、雌蕊、花萼或蜜腺等结构中；以上2种情况，具体哪个部位中有或更多，均有待进一步的研究。

洋槐蜜中黄酮类成分以槲皮素、木犀草素、山柰酚、生松素和白杨素为主，柚皮素、木犀草素和染料木素等为辅；洋槐花中富含儿茶素、芦丁、槲皮素和山柰酚，柚皮素、染料木素、木犀草素、芹菜素的含量居中，其中汉黄芩素的含量最低。通过洋槐花与洋槐蜜平均值(X)分析结果的比较发现：在洋槐花中含量高的化合物，在洋槐蜜中的检出量也相对较高；相反，含量较低的化合物则检出量也较低；而含量极低的化合物(如汉黄芩素)，则因含量低和/或检测限的原因有时未能检出。由上所述，说明花中黄酮类组分及含量与蜂蜜中黄酮类组分及含量之间呈一定程度的正相关，这一结果与Aronne等的研究结果^[15]一致：洋槐蜜中挥发性成分来源于洋槐花整花，其中花蜜占主导性作用，但有些成分仅来源于花瓣、花萼或雄蕊、雌蕊。

有报道称少量的生松素、白杨素和短叶松素存在于只喂养蔗糖糖浆不采集花蜜的蜜蜂产的蜂蜜中，其原因与蜂蜜在精制或成熟过程蜂蜡中黄酮类化合物的迁移或蜜蜂吞咽蜂蜡、蜂胶后再分泌有关^[25]。而本次实验中的洋槐蜜均检出了大量的白杨素和生松素，此结果与Schievano等的检测结果^[10]一致；洋槐花中却未检出白杨素和生松素。此结果显示洋槐花中可能大量存在着白杨素和生松素的糖苷类成分，且此成分在酸水提取时不会分解成苷元，只有经过蜜蜂的酿造才能分解成白杨素和生松素，也许可用以区别非法添加洋槐花水提物的假蜂蜜。

郑永芹等^[26]以刺槐苷和鼠李糖刺槐苷作为指标性成分，分析比较不同采收期对指标性成分含量的影响，发现不同采收期刺槐花中的指标性成分刺槐苷和鼠李糖刺槐苷的含量不同，本次试验5批洋槐蜜中有3批未检出槲皮素，这可能也与蜜蜂采蜜时蜜源花的花期有关。

Tomás-Barberán等^[27]在2001年报道薰衣草蜜和洋槐蜜中没有特别的酚类物质可作为标志物，可通过蜜源与蜜源花间的分析比较发现：洋槐花和洋槐蜜中同时含有少量的染料木素。虽然在油菜蜜和柑橘蜜中都有检出过少量染料木素，但油菜花和柑橘花中均未曾检出，只有在洋槐蜜和洋槐花中同时检出染料木素，且含量均远高于其他蜜种。查阅文献发现目前未见有文献报道将染料木素作为某一蜂蜜中的标志性化合物。也许，可以将染料木素作为潜在的标志物作为研究方向继续深入研究、确认。

3.4 展望

此次研究虽以黄酮苷元为主，但蜜蜂在酿造过程中也会因为蜂蜜的成熟度不够，导致黄酮苷未能全部水解或因蜜蜂的唾液中缺少某种酶而不能将苷转化成苷元，如Truchado等^[11]指出可能因为蜜蜂的唾液中缺少鼠李糖苷酶而导致洋槐蜜中存在山柰酚的糖苷类化合物(山柰酚与鼠李糖和己糖的结合物)，并同时指出这些糖苷类化合物也许可作为区分洋槐蜜植物来源的标志物。因此糖苷类成分的研究也许是研究不同蜂蜜间特征组分的又一途径。另一方面，蜜蜂中因含有水解酶和葡萄糖氧化酶，导致蜂蜜中的成分与花蜜成分不同，未来建立模拟蜂蜜采蜜制蜜的模型也将有助于蜂蜜的研究。

本方法首次采用UPLC-MS/MS法同时分析洋槐蜜和洋槐花中的黄酮类组分，方法专属性强，灵敏度高，但是也存在着提取方法不够完善，目标化合物不够多，分析时间长等特点，这些都有待进一步的完善，UPLC-MS/MS法的应用为单花蜜的鉴定工作提供更为可靠的检测方法奠定基础。通过实验研究发现：蜂蜜中特征成分研究如同药材中活性成分的研究一样，不能以单一成分的存在来判定蜜源，以蜜源花作为“对照药材”寻找不同蜜源蜂蜜中的特征组分是一种可行的方法，且通过含量测定可寻找黄酮类组分含量占比规律，并为蜂蜜中黄酮类组分的指纹图谱奠定研究基础。