牛磺酸是一种β型的含硫氨基酸，人体内牛磺酸总含量约12~18 g，其中3/4以上存在于骨骼肌，血浆中含量极低，仅150 mg左右。牛磺酸对多数器官和系统有着非常重要的作用，体内保持恒定的牛磺酸，能有效消除疲劳。牛磺酸还能预防发育缺陷，视网膜损伤，免疫缺陷，心血管等疾病^[1-2]。

据文献报道^[3-9]，常用的牛磺酸含量检测方法有薄层色谱法、电位滴定法、荧光法、高效液相色谱法等。薄层色谱法属于半定量方法，其灵敏度比较低，且薄层板的制备、点样技术以及展开条件变化因素较多，都会影响定量的准确性；电位滴定法通过测量电位变化确定滴定终点，但电位滴定法干扰因素多，个样的差别较大，无法满足牛磺酸含量较低的样品的测定；荧光法需要对牛磺酸进行衍生化反应，但牛磺酸的衍生物不稳定，衍生后要立即进行分析，故分析过程对实验人员要求较高；高效液相色谱法灵敏度和可靠性高，但仪器比较昂贵，在一定程度上限制了该方法的推广。

拉曼光谱可提供药物相关结构、理化性质等信息，其谱图峰形尖锐，具有数据准确及容易对比等特点^[10-11]。本试验采用拉曼光谱法对牛磺酸片进行鉴别和含量测定，方法操作简单，重复性好，准确性高，可为牛磺酸片的质量控制提供新的分析方法。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Thermo Scientific公司DRX型智能激光拉曼光谱仪，配备780 nm激光发射器，平板式通用样品架，OMNIC分析软件；MILLIPORE公司Milli-Q纯水机。

1.2 试药

牛磺酸对照品(中国食品药品检定研究院，纯度≥99%)，牛磺酸片(辽宁绿丹药业有限公司，批号21023108；南阳普康药业有限公司，批号31022996；焦作福瑞堂制药有限公司，批号42021657；吉林嘉美得科技制药有限公司，批号20150923；长春迪瑞制药有限公司，批号20150706；广东安诺药业股份有限公司，批号20141203。药品规格均为0.4 g·片^-1)，水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品储备液

精密称取牛磺酸对照品2.0 g，置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，制成质量浓度为200 mg·mL^-1的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液

取牛磺酸片10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于牛磺酸0.2 g)，置于10 mL量瓶中，加水7 mL，振摇使主成分溶解，用水定容至刻度，摇匀，经0.45 µm水相滤膜过滤，即得。

2.2 拉曼光谱测定方法与条件

取牛磺酸对照品粉末适量置于石英比色皿中，放在平板式通用样品架上进行光谱测定，得到对照品的拉曼光谱图；另取制备好的供试品溶液1 mL置于石英比色皿中，放在样品架上进行光谱测定。测定条件：激发波长780 nm，激光强度120 mW，光圈50 µm，分辨率1.0 cm^-1，激光聚焦高度6.0 mm，曝光时间60 s，曝光次数3次，扫描范围0~3 500 cm^-1。

2.3 样品的鉴别

本试验以牛磺酸对照品粉末(纯度≥99%，在一定程度上是被认为是纯物质)为参照对象制作对照品谱图，得出的拉曼谱图能最大程度减少杂质干扰，得到的谱图最清晰和标准；而若将供试品牛磺酸片剂直接置于拉曼光谱仪中测定，片剂中的辅料对鉴别结果有很大干扰，因此用水作为溶剂提取片剂中的牛磺酸后再进行鉴别。

拉曼光谱谱图尖锐，容易辨认，可以通过拉曼位移峰对样品进行鉴别，在2 991、2 949、1 629、1 460、1 411、1 337、1 203、1 103、1 041、955、890、832、798、740、587、524、455和353 cm^-1处的拉曼位移峰可共同表征出牛磺酸的结构。牛磺酸对照品粉末和供试品溶液的拉曼光谱图见图 1。由图 1可知，在供试品溶液的拉曼光谱图中可以找到与牛磺酸对照品粉末拉曼光谱图相对应的特征峰，可完成牛磺酸片的快速鉴别。

2.4 定量特征峰的选择

在图 1的拉曼光谱图中可以发现，1 041 cm^-1处的拉曼峰信号响应值最强，因此选作定量特征峰，以该定量特征峰峰面积进行含量计算。

2.5 线性关系考察

精密吸取牛磺酸对照品储备液适量，以水配制质量浓度为5、10、20、30、50、80 mg·mL^-1的溶液，进行拉曼光谱测定，不同浓度对照品溶液的定量特征峰见图 2。以溶液质量浓度为横坐标，以定量特征峰的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其线性方程：

$ \mathit{Y}{\rm{ = 123}}{\rm{.5}}\mathit{X}{\rm{ + 142}}{\rm{.5}}\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{2}} $

结果表明，牛磺酸质量浓度在5~80 mg·mL^-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

取牛磺酸对照品储备液以水逐级稀释并测定，分别得方法检出限(S/N=3) 为0.5 mg·mL^-1，定量限(S/N=10) 为2.0 mg·mL^-1。

2.6 日内和日间精密度试验

取对照品储备液新鲜配制质量浓度为5、10、20、30、50、80 mg·mL^-1的牛磺酸对照品溶液，按“2.2”项下条件于1 d和6 d内重复测定6次，测得日内精密度和日间精密度。结果6个浓度峰面积的日内RSD(n=6) 分别为1.6%、1.3%、0.91%、1.2%、0.88%、1.1%，日间RSD(n=6) 分别为3.7%、3.3%、2.3%、2.2%、1.9%、2.1%，表明该方法精密度良好。

2.7 重复性试验

取牛磺酸片6份，分别制备供试品溶液，按“2.2”项下条件测定样品中牛磺酸的含量，结果分别为98.5%、98.6%、98.9%、99.6%、100.7%、101.1%，RSD为1.1%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取牛磺酸片按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别在温室条件下放置0、0.5、1、1.5、2和3 h后，按“2.2”项下条件进行测定，牛磺酸定量特征峰面积的RSD为1.2%，表明供试品溶液在3 h内稳定。

2.9 加样回收试验

取已测知含量的牛磺酸片20片，研细，精密称取粉末0.3 g，共9份，3份为1组，每组分别加入牛磺酸对照品适量(相当于每组已知量的80%、100%和120%)，按供试品溶液制备方法处理，按“2.2”项条件进行测定并计算牛磺酸的回收率，结果见表 1。

2.10 样品测定

取牛磺酸片样品，按本文的拉曼光谱法测定含量。为验证本方法的可靠性，再按中国药典2015年版二部中的电位滴定法测定含量^[4]。2种分析方法结果(见表 2)，拉曼光谱法与电位滴定法差异不大，测定结果经t检验证明无显著性差异(p=0.831，＞0.05)，本方法可用于牛磺酸片的含量测定。

3 讨论 3.1 专属性考察

拉曼光谱是指一定频率的激光照射到样品表面时，物质中的分子吸收了部分能量，发生不同方式和不同程度的振动，然后散射出较低频率的光，不同原子团振动的方式是惟一的，因此可以产生特定频率的散射光，因此拉曼光谱也称为“指纹光谱”。不同的化学物质，得到的拉曼谱图具有唯一性^[12-14]，因此可以不辅助别的鉴别方法，而依靠拉曼光谱法就能对化学物质进行鉴别。

3.2 2种鉴别方法的比较

中国药典2015年版二部采用茚三酮显色法和红外光谱法鉴别牛磺酸片^[4]。茚三酮显色法操作简单，显色速度快，但是具有游离α-氨基和α-羧基肽的药物与茚三酮都能产生蓝紫色反应，表明该方法专属性差。红外光谱法也能进行药物的鉴别，但水的羟基对测定结果有很大的干扰，需要严格控制样品中水的含量和实验环境的湿度，并且红外光谱在图谱解析方面需要大量经验，容易造成图谱解析障碍^[15-16]。

拉曼光谱法能提供药物结构、理化性质等多种信息，其谱图尖锐，数据准确，容易对比。并且对于拉曼光谱来说，水分子对样品拉曼光谱的影响可以忽略不计。本试验采用拉曼光谱法替换茚三酮显色法和红外光谱法鉴别牛磺酸片，鉴别结果更准确。

3.3 2种含量测定方法的比较

中国药典2015年版二部中采用电位滴定法测定牛磺酸片的含量^[4]。电位滴定法仪器简单，但分析时间较长，每次使用pH计前都必须用已知pH的标准缓冲溶液进行定位校准；进行滴定时，需反复清洗电极；并且其灵敏度受电极电位准确度的限制，当溶液浓度较低时，残余电流容易成为干扰因素^[17]。

电位滴定法测定牛磺酸片含量的操作需加入一定量的甲醛溶液，甲醛具有强烈刺激性气味，对皮肤、呼吸道和消化道黏膜有明显的刺激作用，进入人体可起组织损伤，接触甲醛可能导致自发性流产，还会提高患呼吸道肿瘤的概率^[18-22]。

拉曼光谱法以水作为提取溶剂，减少对健康的危害和环境的污染，并且分析过程样品前处理简单，仪器灵敏度高，实验结果准确。

3.4 供试品溶液过滤方法的选择

本试验以水作为溶剂对牛磺酸片剂主成分进行提取后再测定，但片剂中的辅料不易溶于水，会明显降低拉曼信号值强度，对主成分鉴别和含量测定造成干扰，因此需要除去供试品溶液中的颗粒物。滤纸过滤速度慢且效果不好，本试验用0.45 µm水相滤头进行过滤，过滤速度快，能有效去除供试品溶液中辅料的干扰^[23]。

本试验用水作为溶剂提取样品，以牛磺酸谱图的拉曼位移峰进行鉴别，用拉曼定量特征峰面积进行含量测定。该试验方法样品前处理简单，重复性好，灵敏度高，结果可靠，可用于牛磺酸片的质量控制。