2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 浙江大学医学院附属第一医院临床药学研究中心, 杭州 310003
2. Research Center for Clinical Pharmacy, State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University, Hangzhou, 310003, China
阿齐沙坦（azilsartan）是一种新型血管紧张素抑制剂，能竞争性地阻断血管紧张素与AT1受体的结合，起到降低血压的作用[1-2]。与奥美沙坦、缬沙坦等上一代血管紧张素Ⅱ型受体阻断剂（ARBs）相比，治疗效果更佳，因而在临床上被广泛运用[3-6]。临床前研究表明阿齐沙坦酯也有利于心血管细胞代谢和增强胰岛素活性[7]。作为阿齐沙坦的前体，阿齐沙坦酯口服后被CYP2C9酶快速代谢成活性基团阿齐沙坦，进一步代谢为低活性代谢物（M-Ⅰ）或无活性的代谢物（M-Ⅱ）[8-9]，由此表明阿齐沙坦和阿齐沙坦酯的活性成分均是阿齐沙坦。
目前，阿齐沙坦酯的测定方法有荧光分光光度法[10]和反相高效液相色谱法[11]，而阿齐沙坦的含量测定和药动学研究鲜有文献报道，主要来自于生产厂家说明书或文章[12]，伴随着阿齐沙坦在全球的广泛应用，建立灵敏、快速的测定阿齐沙坦浓度的方法有利于对阿齐沙坦进行进一步药动学、生物利用度、生物等效性的研究。本研究成功建立直接沉淀蛋白法结合色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量检测人血浆中阿齐沙坦的浓度方法，在保证方法准确、重现性高的同时，缩短前处理步骤，实现实验样本的“高通量”测定。
1 仪器Spark Pico system（荷兰Spark公司，荷兰）：Alias自动进样器，二元泵（V20 Pump A & Pump B）、ACE在线小柱系统；API 4000三重四极杆质谱仪（美国应用生物系统公司，美国）；安捷伦公司Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱（3.0 mm×100 mm，3.5 μm；填料：反相烷基化学键合ZORBAX硅胶）；Analyst®software色谱工作站V1.5（美国应用生物系统公司，美国）；QL-901旋涡振荡仪（江苏海门其林贝尔仪器制造公司，中国）；KUDOS超声波清洗器（科导超声仪器有限公司，中国）；Mettler Toledo XS105电子天平（Mettler Toledo公司，瑞士）；Eppendorf 5417c离心机（Abbott公司，德国）；Milli-Q®超纯水系统（Millipore公司，美国）。
2 试药试验制剂阿齐沙坦片（纯度99.8%），批号20110124，江苏恒瑞医药股份有限公司生产。阿齐沙坦对照品，供含量测定用，批号RS1118141013，中国食品药品检定研究院标定。内标奥美拉唑，纯度98.0%，批号100367-200702，中国食品药品检定研究院标定。甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯，水为Milli-Q纯水，氮气（ > 99.9%，NG1000氮气发生器，上海析维生物医药科技有限公司）。
3 方法 3.1 色谱条件采用Agilent ZORBAX SB-Aq（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）色谱分析柱，Waters PN 088084液相色谱柱前过滤器芯片，以5 mmol·L-1甲酸铵水（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0~2 min，10%A；2~4.5 min，10%A→95%A；4.5~6 min，95%A；6~6.5 min，95%A→10%A；6.5~8.5 min，10%A），流速0.6 mL·min-1，柱温40 ℃。
3.2 质谱条件采用大气压电喷雾离子源（ESI），负离子模式，多重反应选择离子监测（MRM）；离子源喷雾电压（IS）为-4.500 kV；干燥器温度（TEM）为500 ℃；阿齐沙坦母离子及子离子：m/z 455→411.2[离子去簇电压（DP）：-10 V；碰撞能（CE）：-26 V；碰撞室出口电压（CXP）：-12 V]，内标物（奥美拉唑）母离子及子离子：m/z 344.1→193.8[离子去簇电压（DP）：-52 V，碰撞能（CE）：-17 V，碰撞室出口电压（CXP）：-4 V]。阿齐沙坦和内标的质谱扫描图见图 1。
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图 1 阿齐沙坦（A）、内标（B）的结构和二级质谱图 Figure 1 The structures and secondary mass spectra of azilsartan (A)and internal standard (B) |
精密称取阿齐沙坦对照品10.04 mg于5 mL量瓶中，以二甲基甲酰胺溶解、定容、混匀，即得2.01 mg·mL-1对照品储备液，于4 ℃冰箱中保存备用；临用前以乙腈将其逐级稀释，得到含阿齐沙坦质量浓度分别为100.5、50.2、20.1、8.04、2.01、0.804、0.503、0.106 μg·mL-1的对照品工作液和质量浓度分别为95.2、5.95、0.238 μg·mL-1的系列质控工作液。
精密称取奥美拉唑（IS）对照品10.70 mg，置10 mL量瓶中，加氨水甲醇溶解，用甲醇定容，混匀后得1.07 mg·mL-1内标储备液，将该内标储备液稀释1 000倍，即得质量浓度为1.07 μg·mL-1的内标工作液。储备液和工作液均于4 ℃冰箱中保存备用。
5 血浆样本的处理方法 5.1 标准血浆样品及质控血浆样品的配制及处理取空白血浆200 mL于1.5 mL离心管中，分别加入不同浓度的对照品工作液或质控工作液20 mL，涡旋30 s混匀，即得含阿齐沙坦质量浓度分别为10.05、5.02、2.01、0.804、0.201、0.080 4、0.050 2、0.010 6 μg·mL-1的标准血浆样品或含阿齐沙坦质量浓度分别为0.01、0.023 8、0.595、9.52 mg·mL-1的定量下限（LLOQ）血浆样品以及低、中、高浓度质控血浆样品，再依次加入内标工作液20 mL和乙腈400 mL，涡旋30 s混匀，13 000 r·min-1离心5 min，取上清10 mL进样。
5.2 受试者含药血浆样品的配制及处理取受试者血浆样品200 mL于1.5 mL离心管中，分别加入乙腈20 mL，涡旋30 s混匀，再依次加入内标工作液20 mL和乙腈400 mL，涡旋30 s混匀，13 000 r·min-1离心5 min，取上清10 mL进样。
6 结果 6.1 标准曲线线性和定量下限按“5.1”项方法配制标准血浆样品并处理，记录阿齐沙坦和内标的色谱峰面积；以阿齐沙坦与内标的峰面积之比（Y）对应其质量浓度（X）进行曲线回归，采用加权（1/x2）最小二乘法进行曲线回归的标准曲线方程（n=3）：
| $Y = ( - 0.007{\rm{ }}9 \pm 0.011{\rm{ }}6){X^2} + (1.22 \pm 0.16)X + (0.0034 \pm 0.001{\rm{ }}6)\quad r = 0.997{\rm{ }}7 \sim 0.999{\rm{ }}5$ |
结果表明阿齐沙坦质量浓度在0.01~10.0 μg·mL-1范围内，与峰面积的比值线性关系良好；阿齐沙坦的LLOQ为0.01 μg·mL-1，实测样品的准确度在92.1%~113%之间，信噪比率（S/N）大于10。
6.2 方法的特异性图 2-A、B、C为空白血浆、LLOQ血浆样品以及健康受试者服药1.0 h后的血浆样品，按“5.1”项方法分别处理，进样后，获取特征图谱。在选定的LC-MS/MS条件下，血浆样品中阿齐沙坦和内标奥美拉唑的保留时间分别为4.15 min和4.76 min左右。观察、比较色谱图。结果表明，空白血浆中的内源性物质和代谢物等不影响阿齐沙坦的准确测定。
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1.阿齐沙坦（azilsartan）2.内标（IS） A.空白血浆（blank plasma）B. LLOQ血浆样品（空白血浆加阿齐沙坦和内标）[LLOQ plasma sample（blank plasma spiked with azilsartan and IS）] C.每人40 mg口服给药后1.0 h的血浆样本（plasma sample 1 h after oral administration of（40 mg per person）） 图 2 测定血浆中阿齐沙坦和内标的MRM色谱图 Figure 2 MRM chromatograms of azilsartan and IS obtained from human plasma samples |
取6份不同批次的空白血浆，涡旋约30 s。每个批次的血浆取3份，每份200 μL，分别置于1.5 mL离心管中，每份分别加乙腈400 μL，振荡30 s，13 000 r·min-1离心5 min，获得相应的上清液置于新的1.5 mL离心管，向其中分别依次加入内标工作液20 μL、精密吸取低、中、高3种浓度阿齐沙坦的质控工作液各20 μL，振荡30 s，13 000 r·min-1离心5 min，取上清液进样。每批次的空白血浆需配制低、中、高浓度质控样品，每个浓度平行制备6份。记录色谱图，阿齐沙坦和内标峰面积分别记为B1和B2。
分别精密吸取阿齐沙坦低、中、高浓度质控工作液各20 μL，向其分别依次加入内标工作液20 μL及水200 μL，涡旋30 s，吸取10 μL进样分析，每个浓度平行配制6份。记录色谱图，阿齐沙坦和内标峰面积分别记为A1和A2。
按ME=B1/A1×100%计算阿齐沙坦的基质效应，按ME=B2/A2×100%计算内标的基质效应，结果见表 1。
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表 1 基质效应及提取回收率结果（n=6） Table 1 Results of matrix effect and extraction recovery |
按“5.1”项方法平行配制阿齐沙坦低、中、高3种浓度血浆质控样本各6份并测定。记录色谱图，阿齐沙坦和内标峰面积分别记为C1和C2。按REC=Ci/Bi×100%计算提取回收率，结果见表 1。
6.5 精密度和准确度按“5.1”项方法配制LLOQ血浆样品（0.01 μg·mL-1）及低（0.023 8 μg·mL-1）、中（0.595 μg·mL-1）、高（9.52 μg·mL-1）浓度的质控血浆样品并处理，计算精密度和准确度（n=6）；1批内测定6次，计算批内变异；连续测定3批，计算批间变异。批内、批间RSD均小于15%，结果见表 2。
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表 2 血浆中阿齐沙坦精密度和准确度（n=6） Table 2 Precision and accuracy of azilsartanin human plasma |
阿齐沙坦对照品储备液和内标储备液在-20 ℃冰箱保存41 d后，与新配制相应储备液同时按“5.1”项方法处理后进行分析，用峰面积积分比值进行比较。结果表明，阿齐沙坦和内标的峰面积积分比值偏差分别为0.52%和2.4%，RSD（n=3）分别为4.0%和4.8%。由此表明，阿齐沙坦对照品和内标的储备液在-20 ℃条件下保存41 d稳定。
按“5.1”项方法配制阿齐沙坦低、中、高3种浓度的血浆质控样品各6份，分别考察血浆样品室温（20 ℃）放置5 h，-70 ℃冰箱中保存并反复冻融3次，-70 ℃冰箱中保存30 d及样品处理后自动进样器（10 ℃）中放置20 h的稳定性。考察结果见表 3，结果表明，在上述保存条件下样品均能保持稳定。
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表 3 多种储存条件下阿齐沙坦和内标稳定性（n=3） Table 3 Stability of azilsartan and IS undervarious storage conditions |
9名健康男性受试者，经体验合格，签署知情同意书，并经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会审批同意，进行药代动力学实验。实验中受试者于用药前10 h禁食，次日早晨口服40 mg阿齐沙坦。受试者于服药前后0.00、0.33、0.67、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、8.0、12.0、24.0和48.0 h从静脉采血4 mL，置于抗凝采血管中，混匀，离心（4 000r·min-1，4 ℃，10 min），分离上层血浆，按“5.1”项方法处理后测定各血浆样品中的阿齐沙坦的浓度。采用WinNolin 6.3计算阿齐沙坦的药动学参数。9名健康受试者口服阿齐沙坦片40 mg后药物动力学参数见表 4，平均血药浓度-时间曲线见图 3。结果表明，建立的阿齐沙坦血药浓度LC-MS/MS分析测定方法适用于阿齐沙坦人体药代动力学的系统研究。
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表 4 9例中国健康受试者口服40 mg阿齐沙坦的药动学参数（n=9） Table 4 Pharmacokinetic properties of 9 Chinese healthy volunteers after oral administration 40 mg of azilsartan |
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图 3 9名健康中国人口服40 mg阿齐沙坦的药-时曲线（mean±SD，n=9） Figure 3 Plasma concentration-time curve of 9 Chinese healthy volunteers after oral administration 40 mg of azilsartan |
在内标筛选过程中，分别尝试氯沙坦、厄贝沙坦、普罗奈尔、奥美拉唑等化合物。仅奥美拉唑做内标时，保留时间与阿齐沙坦相近，质谱行为相似，提取回收率较好（90.6%±3.1%），因此最终选择奥美拉唑作内标。
8.2 分析方法的优化为了获得较好的峰形和最大的响应值，对包括流动相、固定相及柱温等液相色谱条件进行优化。结果发现：1）甲醇作有机相时色谱的峰展宽较窄；乙腈作有机相时色谱峰得到改善，但出现色谱峰拖尾现象；2）水相中加入甲酸或乙酸铵可改善峰拖尾的现象，但甲酸会抑制阿齐沙坦和内标的离子化，加入乙酸铵会极大改善阿齐沙坦和内标的峰形；3）Agilent ZORBAX SB-Aq分析柱（3.0 mm×100 mm，3.5 μm；反相烷基化学键合到特殊的ZORBAX硅胶）的分离效果和峰形显著优于Waters XDB C18和Agilent SB-C18柱（二异丁基正十八烷基硅烷固定相化学键合到高纯的ZORBAX硅胶）。
8.3 标准曲线拟合方式的选择最初在进行标准曲线拟合时，尝试采用加权（1/x）最小二乘法进行曲线回归获得标准曲线方程，但由于阿齐沙坦测定时标准曲线浓度范围相差超过百倍，计算得到的低浓度区域结果准确度达不到法定要求[13]，r值过小。故尝试使用加权（1/x2）进行拟合，测定结果相对偏差在不同浓度区间比较均衡。
9 结论目前国内主要采用HPLC法测定阿齐沙坦的含量[14-16]，关于血浆样本中阿齐沙坦的分析测定鲜有文献报道。本文建立的LC-MS/MS分析方法操作简单，采用直接沉淀蛋白法，准确度高、基质干扰小、重复性好，比适用于阿齐沙坦的临床药动学研究。
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