全柱成像毛细管等电聚焦电泳（whole column imaging detection -capillary isoelectric focusing，WCID-CIEF）是1992年发展起来的一项检测技术，具有分析速度快，重复性好，测定准确等特点，是生物制药分析强有力的工具^[1-3]。WCID-CIEF联用技术综合了CIEF的高分辨和WCID的可提供更多信息的优势，已广泛应用在生物分子的分析和蛋白质与其配体相互作用的研究中。WCID-CIEF克服了传统单点检测等电点的不足，采用一个动态检测器对蛋白质在整个分离通道内不同时间与不同位置上发生的任何变化进行实时监测，省去了烦琐的区带移动过程，既缩短了分析时间，又保证了蛋白质的分离度和分辨率，使得蛋白质等电点值的测定变得简单。由于生物制品的翻译修饰等均可导致电荷异质性，而某些电荷异质性对生物制品的稳定性和有效性会产生重要的影响，因此在临床前研究及生物制品的质量标准中对等电点的研究是非常重要的，本研究中建立了多肽样品、胰岛素、融合蛋白疫苗和HPV病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）4种生物制药等电点检测的方法^[4-5]，结果表明该方法准确、灵敏、简便、快速。

1 仪器、试剂及样品 1.1 仪器

iCE280 advance毛细管等电聚集分析仪，荣捷生物工程（苏州）有限公司。

1.2 主要试剂

iCE280 Electrolyte kit（Record No.102506）、1% MC solution（Record No.101876及等电点标准品pI 8.18（Record No.100221）、pI 4.65（Record No.100207）均购自ProteinSimple公司；cIEF Peptide Marker Kit（Record No.A58481）购自Beckman Coulter公司；Pharmalyte 3~10（Record No.17-0456-01）、Pharmalyte 8~10.5（Record No.17-0455-01）、Urea（Record No.17-1319-01）均购自GE-Healthcare；全柱成像毛细管柱Record No.CMSZ0171购自荣捷生物工程（苏州）有限公司。

1.3 样品

多肽样品名称为KR-1，批号20160408，重庆科润生物医药研发有限公司生产；融合蛋白疫苗样品名称为KH1，批号20160228，重庆科润生物医药研发有限公司生产；德谷胰岛素（insulin degludec），批号ES6T553，诺和诺德公司（Novo Nordisk）生产；重组人乳头瘤病毒原液分别为HPV31L1（批号P2015063101C）、HPV33L1（批号P2015063302C）、HPV45L1（批号P2015064502C）、HPV52L1（批号P201 5065203C）、HPV58L1（批号P2015075803C），均由上海博唯生物科技有限公司生产。

2 方法 2.1 多肽等电点方法

取脱盐后多肽样品10 μL，pH 3~10两性电解质（Pharmalyte）6 μL；pH 8~10.5两性电解质（Pharmalyte）2 μL，1%甲基纤维素（MC）70 μL，pI 5.5 Marker 1 μL，pI 9.5 Marker 1 μL，加水110 μL混匀，6 000 r·min^-1离心2 min后加入样品管中等待上样；设备运行程序为1.5 kV聚焦1 min及3 kV聚焦8 min。根据仪器要求输入样品信息和等电点标准品的等电点，设置设备运行程序，进样。

2.2 激素等电点方法

取脱盐后激素样品胰岛素10 μL，尿素24 mg，pH 3~10两性电解质（Pharmalyte）8 μL；1%甲基纤维素（MC）70 μL，pI 4.1 Marker 1 μL，pI 7.0 Marker 1 μL，加水110 μL混匀，6 000 r·min^-1离心2 min后加入样品管中等待上样；设备运行程序为1.5 kV聚焦1 min及3 kV聚焦4 min。根据仪器要求输入样品信息和等电点标准品的等电点，设置设备运行程序，进样。

2.3 融合蛋白疫苗等电点方法

取脱盐后融合蛋白疫苗样品10 μL，尿素96 mg，pH 3~10两性电解质（Pharmalyte）8 μL；1%甲基纤维素（MC）70 μL，pI 4.65 Marker 1 μL，pI 8.18 Marker 1 μL，加水110 μL混匀，6 000 r·min^-1离心2 min后加入样品管中等待上样；设备运行程序为1.5 kV聚焦1 min及3 kV聚焦4 min。根据仪器要求输入样品信息和等电点标准品的等电点，设置设备运行程序，进样。

2.4 病毒样颗粒等电点方法

取脱盐后病毒样颗粒HPV 31L1、HPV 33L1、HPV45L1、HPV 52L1和HPV58L1样品各10 μL，尿素24 mg，pH 3~10两性电解质（Pharmalyte）8 μL；1%甲基纤维素（MC）70 μL，pI 5.5 Marker 1 μL，pI 9.5 Marker 1 μL，加水110 μL混匀，6 000 r·min^-1离心2 min后加入样品管中等待上样；设备运行程序为1.5 kV聚焦1 min及3 kV聚焦4 min。根据仪器要求输入样品信息和等电点标准品的等电点，设置设备运行程序，进样。

3 结果

在分析方法验证中等电点的检测属于鉴别试验，需要进行专属性验证，分别取等电点标准品以及等电点标准品和样品进行等电点试验，结果表明在样品峰附近均无其他杂质峰，均符合验证的要求。多肽样品的相对分子质量约3.5×10³，在检测波长280 nm处吸收较弱，故此样品峰的峰高相对较低，实测等电点为10.98，与理论等电点10.9基本一致，详见表 1和图 1。激素样品胰岛素的相对分子质量约6.1×10³，实测等电点为5.87，与理论等电点5.4相差0.4，基本一致，详见表 1和图 2。融合蛋白疫苗样品单体相对分子质量约70×10³，实测等电点为5.86，与理论等电点6.1相差0.24，基本一致，详见表 1和图 3。病毒样颗粒样品为重组人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV），31、33、45、52、58型主要衣壳蛋白L1，由72个主要衣壳蛋白Ll蛋白五聚体组成的病毒样颗粒，理论相对分子质量均约2×10^7[6-9]。HPV 31L1、HPV 33L1、HPV 45L1、HPV 52L1和HPV 58L1 VLPs的实测等电点分别为8.17、7.86、7.77、7.91和7.69，详见表 1和图 4。HPV理论等电点与实测等电点相差分别为0.63、0.64、0.73、0.69和0.91。由于HPV L1发酵表达产物病毒样颗粒可能大小不均匀，稳定性也相对较差。在HPV病毒样颗粒样品的纯化过程中均采用解聚重组装工艺，得到结构均一病毒样颗粒。一般来说病毒样颗粒的结构复杂，分子量巨大，可能存在翻译后修饰，比如糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化等，虽然这些修饰对分子量的影响比较小，但对于等电点的影响稍微大一些。据文献报道，6种诺如病毒的病毒样颗粒理论等电点与实测等电点差值从0.1~1.7^[10]。一般来说对于分子量较小，结构较简单的蛋白质，理论等电点的计算与实际情况较为相符，理论等电点与实测等电点差值一般在0.5以内，而对于病毒样颗粒，相对分子质量上千万级，并且结构复杂，在形态上与真正病毒粒子相同或相似，因此理论等电点与实测等电点差值相对较高些。另外，HPV L1在等电聚焦过程中容易发生聚集，所以一般很难得到重复性较好的结果，为考察方法的精密度，取HPV 52L1进行3次重复性实验，等电点结果分别为7.97、7.95和7.96，说明此方法重复性较好，详见图 5。

4 讨论 4.1 WCID-CIEF实验条件的选择

对于此多肽的理论等电点为10.9，为更好进行聚焦，加入pH 8~10.5两性电解质（Pharmalyte），一般情况下，加入窄范围的两性电解质会延长聚焦时间，通过对等电聚焦4、8min等的摸索，发现等电聚焦8 min更利于样品的聚焦完全，结果更准确稳定。对于激素样品胰岛素，分别摸索了0、2、4、8 mol·L^-1尿素，以及等电聚焦4、8 min等实验条件，发现2、4 mol·L^-1尿素和等电聚焦4 min的实验条件最佳；对于融合蛋白疫苗，摸索了0、2、4、8 mol·L^-1尿素，并通过对等电聚焦4、8 min等的摸索，当尿素浓度为0、2、4 mol·L^-1时，未见样品峰，故最终选择8 mol·L^-1尿素和等电聚焦4 min的实验条件最佳；对于病毒样颗粒样品重组人乳头瘤病毒，摸索了0、2、4、8 mol·L^-1尿素，并通过等电聚焦4、8 min等的摸索，不加尿素时未见样品峰，加入2~8 mol·L^-1尿素时样品均可检测，故最终选择2 mol·L^-1尿素和等电聚焦4 min的实验条件。综上所述，一般情况下如果处理条件中不加尿素，3 kV聚焦时间建议8~10 min，如果加入2~8 mol·L^-1尿素，3 kV聚焦时间建议4~6 min。在等电聚焦中尿素是一种稳定性，它可以有效地减少样品在等电聚焦过程中的聚集和沉淀，提高结果的准确性和重复性。

4.2 WCID-CIEF与其方法的比较

凝胶等电聚焦法是1966年由瑞典科学家发明，原理是在凝胶中加入两性电解质载体，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处，形成一个很窄的区带^[10-14]。优点：重复性好，样品容量大，实验设备较便宜；缺点：操作较烦琐，分辨率较低，准确定量较难，并且对于融合蛋白疫苗、病毒样颗粒等分子量巨大的样品，进行平板凝胶电泳时样品大部分停留在加样孔处，并不能在电场的作用下进行迁移，因此采用平板凝胶等电聚焦法无法检测到此类样品的等电点。毛细管等电聚焦技术虽然具有较好的分辨率和定量准确性优势，但由于聚焦完成后需要通过机械力或电场力将聚焦分离的各组分通过一个固定的检测窗口进行检测，这容易造成谱带展宽及变形。对于相对分子质量较小的样品可以得到准确的等电点结果，但对于像融合蛋白疫苗以及相对分子质量千万级的病毒样颗粒样品虽然经过多次实验均不能检测出等电点，目前国内未见毛细管等电聚焦法检测出病毒样颗粒HPV等电点的报道。WCID-CIEF相对于其他等电点检测技术来说最大的优点是可以实时观察样品在等电聚焦过程中的情况，及时调整聚焦时间等参数，并且在蛋白分离后没有移动过程，适合于多肽、激素、融合蛋白疫苗、病毒样颗粒等相对分子质量从几千到几千万的各种生物制品的等电点分析^[15-16]，是一种准确、灵敏、简便、快速的等电点分析方法，对于监控生物制药生产工艺的稳定性及生物制药的质量控制具有非常重要的意义。

【致谢：感谢蔡瑞[荣捷生物工程（苏州）有限公司]提供毛细管等电聚集分析仪及所有实验用试剂及毛细管柱！】