2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
在肠外药品包装容器/密闭系统中，弹性体瓶塞（例如橡胶塞）一直是一种重要组件[1]。至关重要的是，要对不同配方的胶塞与药物产品稳定性的效果进行全面评估。胶塞的配方是极其复杂的，包括生胶、抗氧剂、增塑剂、硫化剂、促进剂、防老剂、活性剂和着色剂等[2]。普通橡胶塞或者覆膜胶塞内含有的一些添加成分给生产的胶塞带来一定的理想效果的同时，也极有可能与药物发生相互作用从而改变药物的物理性能甚至化学和生物学性能，污染药物，构成潜在的健康危害[3]。为延长胶塞材料的寿命，抑制或延缓材料的氧化降解，通常添加抗氧剂。但是食用过量的抗氧剂，对人体的心、肺、肾、肝等器官有很大的危害，甚至导致突变和致癌[4]。美国联邦法规（CFR）规定“药品容器和密封件不应与药物发生反应，发生吸附或者迁移，从而改变药物的安全、质量及纯度”[5]。
抗氧剂264（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，2，6-di-tert-butyl-4-methylphenol，简称BHT），是一种优良的通用型酚类抗氧剂[6]，广泛用于橡胶塞的生产中。美国FDA批准药物非活性成分数据库对静脉注射类抗氧剂BHT规定最大用量为0.002%[7]。欧洲药典[8]也对抗氧剂在药品包装中的最大用量做出了规定为0.3%。BHT有抑制人体呼吸酶活性、增加肝脏微体酶活性等作用，美国FDA癌症评估委员会也在考虑BHT的致癌性[9]。鉴于包装材料对食品药品安全的重要影响，各国对抗氧剂有着严格的限量规定。硫磺可与异戊二丁烯形成交联的二硫键，起到一定的硫化作用，是一种最早应用的硫化剂[10]，能更好地提升丁基胶塞的物理化学性能。硫在丁基胶塞中的溶解性很低，当硫使用过量时，其溶解度达到饱和，硫会从胶料内部析到表面上，从而产生喷霜的现象[11]。胶塞喷霜，一方面会破坏硫在胶料中分散的均匀性，降低胶料表面的粘着性，给加工带来困难；另一方面也会影响被包装药物的质量[12-13]。因此有必要控制可提取硫的含量。
基于上述抗氧剂和硫化剂这2种添加剂控制的必要性，本文建立了有机溶剂回流萃取的方法对2种添加剂进行抽提，并以高效液相色谱法进行测定，可方便准确的同时测定药用丁基胶塞中2种添加剂的含量。
1 仪器与试药Agilent 1260高效液相色谱仪，VWD检测器，OpenLAB色谱数据工作站（安捷伦公司）。Diamonsil C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；迪马科技有限公司）。
对照品硫（批号13803）纯度99.5%~100.5%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；对照品BHT（批号BCBL8167V）纯度99%，ALDRICH试剂；水为超纯水，乙腈为色谱纯，无水乙醇和二氯甲烷等均为分析纯。7个批次的药用丁基橡胶塞均由国内A~E共5个生产企业提供。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：含0.1%三氟乙酸的乙腈-含0.1%三氟乙酸的水（90:10）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；紫外检测波长：280 nm；进样量：20 μL。
2.2 供试品溶液的制备将药用胶塞剪碎，精密称取4.0 g，置100 mL磨口硼硅玻璃烧瓶中，精密加入二氯甲烷-无水乙醇（1:1）10 mL，精密称定，煮沸回流4 h，冷却至室温，用二氯甲烷-无水乙醇（1:1）补充减失的量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.3 系列混合对照品溶液的制备分别精密称取BHT和硫的对照品适量，置同一量瓶中，加二氯甲烷-无水乙醇（1:1）配成每1 mL含BHT和硫均为100 μg的混合对照品储备液；精密吸取上述储备液适量，用二氯甲烷-无水乙醇（1:1）依次稀释成每1 mL含BHT和硫均分别为60、40、20、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 μg的混合溶液，即得。
2.4 线性关系考察精密吸取“2.3”项下系列混合对照溶液20 μL，在“2.1”项下色谱条件下，分别注入色谱仪中，测定色谱峰面积，以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示：BHT质量浓度在0.41~103.00 μg·mL-1范围内线性关系良好，硫质量浓度在0.10~103.50 μg·mL-1范围内线性关系良好；BHT和硫回归方程：
| $A{\rm{ = 9}}{\rm{.636}}C + {\rm{1}}{\rm{.421}}\quad {r^{\rm{2}}}{\rm{ = 1}}{\rm{.000}}$ |
| $A{\rm{ = 26}}{\rm{.980}}C - {\rm{1}}{\rm{.334}}\quad {r^{\rm{2}}}{\rm{ = 0}}{\rm{.999 9}}$ |
取“2.3”项下质量浓度为0.8、20、40 μg·mL-1的混合对照品溶液，连续进样6次，测定色谱峰面积；结果表明BHT峰面积的RSD分别为1.07%、0.69%、0.20%，硫峰面积的RSD分别为0.79%、0.95%、0.17%。精密度良好。
2.6 稳定性试验取“2.3”项下质量浓度为0.8、20、40 μg·mL-1的混合对照品溶液，分别在室温放置0、12、24 h时进样20 μL，测定色谱峰面积；结果BHT峰面积的RSD分别为0.93%、1.1%、1.3%，硫峰面积的RSD分别为1.2%、1.8%、1.2%。表明混合对照品溶液室温放置24 h基本稳定。
2.7 重复性试验精密称取同一批胶塞样品（批号F141100701）6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定峰面积；结果样品中BHT的含量为0.020 6%，RSD为0.70%；可提取硫的含量为0.001 6%，RSD为1.0%。
2.8 回收率试验取已知含量的胶塞样品（批号F141100701）4 g，精密称定，置圆底烧瓶中，3个一组，分别精密加入混合对照品高浓度溶液（含BHT：500 μg·mL-1；硫：60 μg·mL-1）、中浓度溶液（含BHT：250 μg·mL-1；硫：30 μg·mL-1）、低浓度溶液（含BHT：125 μg·mL-1；硫：15 μg·mL-1）1 mL，按“2.2”项下方法制备供试溶液，进样20 μL，测定峰面积。结果本方法的BHT和硫平均回收率分别为95.24%和86.78%。结果见表 1。
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表 1 回收率试验结果（%） Table 1 Results of recovery test |
取“2.3”项下混合对照品溶液适量，以二氯甲烷-无水乙醇（1:1）逐级稀释测定，记录色谱图，当信噪比S/N为3:1时，BHT、硫的最低检出限分别为102、21 ng·mL-1。
2.10 样品的测定取药用丁基胶塞7批，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，以标准曲线法计算样品中BHT和可提取硫的含量。测定结果见表 2，典型色谱图见图 1。
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表 2 药用丁基胶塞中BHT和可提取硫的测定结果（μg·g-1） Table 2 Determination results of BHT and extractable sulphur in medicinal butyl rubber |
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1.BHT 2.可提取硫（extractable sulphur） 图 1 对照品（A）及药用丁基胶塞样品（B）HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance(A)and medicinal butyl rubber sample(B) |
试验所用溶剂为二氯甲烷-乙醇（1:1），通过对比无水乙醇、乙腈作为提取溶剂，本文采用的提取溶剂对BHT和可提取硫2种待测物质提取更较为完全。另外通过对比同种产品回流提取2、3、4、5 h的测定结果，提取5 h与4 h相比无显著差异，因此确定提取时间为4 h。测定结果见表 3。
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表 3 不同提取时间样品提取结果（μg·g-1） Table 3 Results of different extraction time |
分别以欧洲药典收录的三相系统乙腈-四氢呋喃-水（62:30:8）、乙腈-水（90:10）、乙腈（0.1%三氟乙酸）-水（0.1%三氟乙酸）（90:10）作为流动相进行考察，结果以乙腈（0.1%三氟乙酸）-水（0.1%三氟乙酸）（90:10）系统对待测物的分离效果好，色谱峰峰形更加对称，故选择乙腈（0.1%三氟乙酸）-水（0.1%三氟乙酸）（90:10）作为测定的流动相。
3.3 测定结果分析国家药包材标准YBB00142002-2015药品包装材料与药物相容性试验指导原则中指出鉴于橡胶配方的复杂性，应重点考察其中各种添加物的溶出对药物的作用，橡胶对药物的吸附以及填充材料在溶液中的脱落[14]。欧洲药典7.0对聚丙烯材料中抗氧剂的含量有明确规定，要求不得过0.3%。本文参考该标准要求，对7批胶塞产品中的抗氧剂进行测定，抗氧剂总量均小于0.3%。7批药用胶塞中可提取硫含量为1~143 μg·g-1。由于各国标准暂未收载药用胶塞中可提取硫含量的控制标准，因此对于测定结果不做进一步评价。不同厂家的BHT和硫含量差异较大，主要是由于各厂家胶塞在原材料、配方等方面差异较大造成的，没有统一的配方标准，因此也更需要对胶塞中的BHT和硫进行检测监控。
本研究提供的方法可以简单快速的测定药用丁基橡胶塞中抗氧剂BHT和可提取硫的含量，为进行胶塞与药物相容性试验，进一步评价药用丁基胶塞的稳定性、安全性提供了可以借鉴的方法。
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