2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 岛津企业管理(中国)有限公司, 上海 200052
2. SHIMADZU Enterprise Management(China) Co., Ltd, Shanghai 200052, China
咪达唑仑（1-甲基-8-氯-6-（2-氟苯基）-4H-咪唑并[l，5-a][l，4]苯并二氮杂䓬）为苯骈二氮杂䓬类衍生物，是一种短效的中枢神经系统（CNS）镇静剂，具有临床起效快[1-4]，血浆清除快[5-6]，作用时间短，强效，并发症少，副作用小等特点。主要用于麻醉前给药、全麻醉诱导和维持、椎管内麻醉及局部麻醉时辅助用药、诊断或治疗性操作时病人的镇静、ICU病人的镇静等[7-9]。
咪达唑仑多以N-脱烷基氟西泮为起始原料，经甲胺化、亚硝化、置换、氢化、环合、氧化等单元反应制备而得。中国药典自2010年版开始收载咪达唑仑原料及咪达唑仑注射液，注射液有关物质限度为单个杂质不得过0.5%，总量不得过1.0%[10]。中国药典中咪达唑仑有关物质的液相色谱检查方法与英国药典[11]相同，能有效地分离英国药典和美国药典[12]收载的11个已知杂质，本文采用该方法对咪达唑仑注射液有关物质进行考察。
咪达唑仑注射液为咪达唑仑含盐酸的溶液，由于咪达唑仑在盐酸溶液中，其结构在4，5双键位间发生开环可逆性水解，形成相应的开环性化合物（在本色谱条件下相对保留时间约为0.42），当pH升高后，开环物又重新环合。英国药典和美国药典中均规定有详细的样品处理方法使得开环物转化为闭合物（即咪达唑仑），中国药典方法为采用加碱的方法来完成转化。试验中发现注射液经英国药典、美国药典及中国药典的3种方法经转化后相对保留时间为0.42的位置均能检出色谱峰，且为咪达唑仑注射液中最大单杂。国内企业认为该物质为开环物，在体内可以全部闭环转化为咪达唑仑，不应将其计为杂质[13-14]，故该物质结构确认极为重要。
用LC-MSn法可以实现对检出杂质结构的快速推定，但中国药典2015年版中的有关物质测定方法（HPLC-UV）的流动相中含有较高浓度的磷酸及三乙胺，与质谱检测的要求不匹配，通常的做法是，重新建立适合LC-MS检测的色谱系统，该方法可对检出杂质结构进行推定，但无法实现对三国药典条件下色谱图中各杂质峰的准确指认，为此，本研究采用在线脱盐-高效液相色谱-离子肼-飞行时间质谱（2D-LC-IT-TOF/MS）方法，即通常所说的在线脱盐技术，该方法基于共用一组分收集环（fraction loop）的二维液相色谱-质谱联用系统建立，其中一维液相色谱对三国药典条件下含有磷酸盐和三乙胺等试剂的液相条件进行分析，通过实践程序对分离过程中的目标杂质进行捕集，1stD-LC分析结束后，批处理自动执行二维液相色谱分析，收集环中的杂质组分分批依次注入二维液相色谱柱中，对目标峰快速分析的同时完成流动相转换即脱盐的过程{15}。该方法在不改变原流动相条件的基础上，实现了液相色谱联用分析目标杂质，可在准确推定检出杂质结构的同时，实现对三国药典条件下色谱图中各杂质的准确定位。
1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦公司ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）色谱柱，岛津公司Inertsurstain C18（2.0 mm×50 mm，2.1 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）色谱柱，高效液相色谱-离子肼-飞行时间质谱仪（日本岛津公司）包括LC-20AD×4（输液泵），SIL-20AC（自动进样器），CTO-20AC（柱温箱），CBM-20A（系统控制器），DGU-20A5（在线脱气机），SPD-M20A（二极管阵列检测器），SPD-20A（UV检测器），FCV-12AH×3（高压流路选择阀），FCV-14AH×2（色谱柱切换阀），离子阱-飞行时间质谱仪（LC/MS-IT-TOF仪）和LC MSsolution Ver.3.70（工作站）。
1.2 试药咪达唑仑注射液（甲厂，批号20150506；乙厂，批号1150602 A3；丙厂，批号20150506）；咪达唑仑对照品（中国食品药品检定研究院，批号171265-201402）；英国药典杂质D、G对照品（杂质D：8-氯-6-（2-氟苯基）-1-甲基-4H-咪唑并[1，5-a][1, 4]-苯并二氮杂-5-氧化胺；杂质G：8-氯-6-苯基-1-甲基-4H-咪唑并[1，5-a][1, 4]-苯并二氮杂）（恩华药业股份公司，批号0142、0136）；乙腈为色谱纯，醋酸铵、依地酸二钠、三乙胺、甲酸均为分析纯，水为Millipore纯化水。
2 方法与结果 2.1 色谱与质谱条件 2.1.1 色谱条件1stD-LC色谱条件：采用Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以磷酸盐缓冲液（0.1 mol·L-1磷酸溶液-0.03 mol·L-1三乙胺溶液（1:1）混合，0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH至3.5）-甲醇（35:65）为流动相，流速1 mL·min-1，柱温40 ℃，进样体积10 μL，检测波长220 nm。
2ndD-LC色谱条件：采用Inertsurstain C18（2.0 mm×50 mm，2.1 μm）色谱柱，以pH 3.5甲酸溶液（A）-为甲醇（B）为流动相，梯度洗脱（0~1 min，10%B；1~5 min，80%B；5~6 min，80%B；6~7 min，10%B；10 min，10%B）（梯度开始1 min后阀切换流路进质谱仪），流速0.3 mL·min-1，柱温：40 ℃，检测波长：220 nm，进样体积20 μL（Loop环体积）。
2.1.2 质谱条件离子源：ESI正离子；离子源电压：ESI+，4.5 kV；扫描范围：一级质谱m/z 150~500；多级质谱m/z 100 ~500；雾化气：氮气1.5 L·min-1；干燥气：氮气10 L·min-1；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：200 ℃；加热模块温度：200 ℃；检测器电压：1.6 kV；校准方法：自动调谐优化电压，外标法校准质量数。
2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备称取英国药典杂质G对照品25.16 mg，英国药典杂质D对照品25.36 mg，依地酸二钠450.06 mg，分置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；再分别精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 中国药典供试品溶液取本品适量（约相当于咪达唑仑5 mg），置10 mL量瓶中，加0.01 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，避光放置1 h，用流动相稀释至刻度，避光放置3 h，即得。
2.2.3 英国药典供试品溶液取本品适量（约相当于咪达唑仑5 mg），置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，避光放置2 h，即得。
2.2.4 美国药典供试品溶液取本品适量（约相当于咪达唑仑5 mg），置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，将溶液转移至适宜容器中，40 ℃加热1 h，即得。
2.2.5 强制性破坏溶液的制备 2.2.5.1 酸破坏供试品溶液取本品适量（约相当于咪达唑仑5 mg），置10 mL量瓶中，加2 mol·L-1盐酸溶液2 mL，放置24 h，加2 mol·L-1氢氧化钠2 mL中和后，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.5.2 碱破坏供试品溶液取本品适量（约相当于咪达唑仑5 mg），置10 mL量瓶中，加2 mol·L-1氢氧化钠溶液2 mL，放置24 h，加2 mol·L-1盐酸溶液2 mL中和后，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.5.3 氧化破坏供试品溶液取本品适量（约相当于咪达唑仑5 mg），置10 mL量瓶中，加1.5%双氧水溶液2 mL，放置0.5 h，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.5.4 高温破坏供试品溶液取本品适量（约相当于咪达唑仑5 mg），105 ℃加热12 h后放冷后，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.5.5 光照破坏供试品溶液取本品适量（约相当于咪达唑仑5 mg），置4 500 lx光照24 h后置10 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3 咪达唑仑注射液有关物质的结构解析取“2.2.1”~“2.2.4”项下的溶液，按“2.1”项下条件测定，测得有关物质结果见表 1，拟合HPLC色谱图见图 1，甲、乙、丙3个厂家样品共检出除咪达唑仑外4个色谱峰，按出峰顺序命名为峰1~5（如图 1）。不同企业产品中，仅有乙厂样品中检出了峰1，仅在丙厂样品中检出峰3，峰2、4及峰5为共有色谱峰，其中峰2为最大杂质，相对保留时间约为0.42，为重点关注的杂质。峰1与依地酸二钠在色谱保留行为、紫外光谱行为均一致，两者的一级质谱与多级质谱质谱图一致，故峰1为辅料依地酸二钠。
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表 1 中文标题 Table 1 英文标题 |
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1.依地酸二钠（disodium edetate）2.杂质1（impurity 1）3.杂质2（impurity 2）4.咪达唑仑（midazolam）5.杂质3（impurity 3） 图 1 咪达唑仑注射液拟合全部杂质的一维UV色谱图 Figure 1 The first dimentional UV chromatogram of midazolam injection |
杂质2、3的质谱数据见表 1。杂质2（峰3）、杂质3（峰5）分别与英国药典杂质D、G的色谱保留行为、紫外光谱行为一致，一级质谱与多级质谱图也均一致。由表 1数据可见，杂质2即为英国药典杂质D，杂质3即为英国药典杂质G。
2.3.2 咪达唑仑注射液中杂质1（最大杂质）的2D-LC-IT-TOF分析结果采用加碱后避光放置（中国药典方法）、避光放置（英国药典方法）及加热放置1 h（美国药典方法）3种方法制备供试品溶液，结果发现在不加碱及加热的供试品溶液中相对保留时间为0.42的色谱峰中检出m/z 344.093 1和m/z 326.082 5的2种杂质，见图 2；而在加碱的供试品溶液中相对保留时间为0.42的色谱峰中只存在m/z 326.082 5这1种杂质，见图 3。m/z 326.082 5的杂质在二维UV色谱图上的出峰时间与咪达唑仑不同，可以推断该物质并非咪达唑仑。该杂质[M+H]+ m/z为326.082 5，二级质谱碎片离子为m/z 291.114 2、244.030 2、249.005 6，三级质谱碎片离子为m/z 249.080 5、223.077 1、208.006 0。其一级质谱可以看到明显的Cl的同位素峰，主成分咪达唑仑[M+H]+ m/z 326.082 8，二级质谱碎片离子为m/z291.114 7、244.030 2、249.079 8，三级质谱碎片离子为m/z 249.079 9、223.077 6、208.054 8、129.056 2，其一级质谱可以看到明显的Cl的同位素峰，相对分子质量与主成分一致，多级质谱也与咪达唑仑（多级质谱解析详见图 4）相同，推测为咪达唑仑同分异构体，此杂质未见国内外文献报道。杂质1、咪达唑仑和共轭开环物的多级质谱信息见表 2。
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图 2 英国药典供试品溶液中杂质1的二维质谱中m/z 326.08和m/z 344.09提取离子流图 Figure 2 Extraction chromatograms of m/z 326.08 and m/z 344.09 in 2D-MS of impurity 1 in BP test solution |
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图 3 中国药典供试品溶液中杂质 1 的二维质谱中 m/z 326.082 8 和 m/z 344.093 1 提取离子流图 Figure 3 Extraction chromatograms of m/z 326.082 8 and m/z 344.093 1 in 2D-MS of impurity 1 in ChP test solution |
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图 4 咪达唑仑的结构及质谱裂解途径 Figure 4 The structure and fragmentation pathway of midazolam |
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表 2 中文标题 Table 2 英文标题 |
为了探究杂质1来源，对咪达唑仑注射液按“2.2.4”方法进行了强制性破坏，结果见图 5。本品在酸、碱、氧化、高温、强光破坏下均不稳定，破坏后均能产生不同程度的主要降解产物咪达唑仑异构体，在氧化和酸破坏条件下，异构体产生的量约为3%的咪达唑仑。结果显示，咪达唑仑在注射液酸性条件下不稳定，易产生杂质1。
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图 5 咪达唑仑注射液破坏性试验色谱图 Figure 5 Chromatograms of midazolam Injection undergoing decomposition |
本实验采用2D-LC-IT-TOF/MS法，即在LC-IT-TOF的基础上增加了在线脱盐技术，对药典条件下咪达唑仑注射液中色谱图中准确指认的3个有关物质进行了定性分析，该方法操作快速、简便，且能与含非挥发性酸、碱的流动相直接匹配。
3.2 加强对辅料的关注乙厂产品中检出辅料依地酸二钠，其含量约为0.4%的咪达唑仑的含量，因在目前的中国药典标准中未体现，极易在日常检验中误判为杂质。提示有类似辅料干扰时，一要在标准中加以关注，二是检验者应对制剂处方加以了解。
3.3 咪达唑仑注射液中已知杂质的来源国产咪达唑仑注射液中共检出2种已知杂质，分别为英国药典杂质D及G。杂质G为咪达唑仑起始原料邻氟环合物中的2-氨基-5-氯-二苯甲酮杂质，在后续的反应中会生成，杂质D为反应生成的副产物，在咪达唑仑的合成工艺中氧化反应可生成该杂质。此实验结果提示企业需在原料药生产时加强对这2种杂质的监控。
3.4 咪达唑仑注射液中未知杂质的来源的探讨本文实验结果显示在中国药典有关物质条件下，样品中存在的咪达唑仑开环物已全部转化为咪达唑仑，而相同相对保留时间0.42下的检出物为咪达唑仑异构体，对咪达唑仑注射液制剂所用对应批号原料的有关物质进行检测，未检出该相同物质，制剂的强酸破坏实验显示咪达唑仑异构体的量显著增加，提示咪达唑仑在注射液的酸性条件下，在开环成为4，5-开环物时或有部分结构变化生成异构体。
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