2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 北京大学药学院, 北京 100191
2. SchooL of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China
对照提取物是近年来发展的一种解决中药化学对照品短缺，提高中药质量控制水平的重要方法[1]。随着中药单一对照品供应及在使用过程中暴露出来的问题和整体质量控制理念的深入人心，对照提取物的制备及应用研究日益广泛[2-14]。
常用中药甘草性平，味甘，归十二经，功能补脾益气，滋咳润肺，缓急解毒，调和百药[15]，有“十方九草”之说，2015年版《中华人民共和国药典》收录含有甘草的中成药处方约400个，随着中药质量控制水平的不断提高，对甘草进行含量测定的需求旺盛，对照品供应不足的问题日趋严重，为解决这一问题我们拟开展甘草对照提取物的研究工作。
鉴于甘草成分的复杂性及其在不同制剂中提取方法的不同，很难找到一种方法制备得到的对照提取物能满足所有含甘草制剂的定量需求，本着逐步推进的原则，本文甘草对照提取物的制备拟用于中国药典收载处方，以甘草浸膏为君臣药投料的中成药的含量测定。课题组确定了基于甘草浸膏制备工艺的提取物制备思路，采用正交试验方法对提取工艺及大孔树脂富集工艺进行了研究，另文报道。本试验中制备了3批甘草对照提取物，并对提取物的质量标准进行了研究，为该对照提取物用于相关制剂的定量研究奠定坚实的基础。
1 仪器与试药Agilent 1260型高效液相色谱仪（Agilent公司）；Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Phenomenex公司）；AB-8大孔吸附树脂（天津化工厂），预制硅胶GF254薄层板（10 cm×20 cm；Merck公司），RP-18 F254s薄层板（10 cm×20 cm；Merck公司）。
甘草苷（供含量测定用，批号111610-200503），甘草酸铵（供含量测定用，批号110731-201317，含量92.6%），由中国食品药品检定研究院提供。芹糖甘草苷、甘草苷元和芹糖异甘草苷由本实验室自乌拉尔甘草中提取得到，纯度大于95%。3批次（批号分别为20140108、20140306、20140512）各10 kg甘草药材均经北京市药品检验所陈有根主任药师鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，分别购自北京康仁堂药业有限公司、双桥燕京饮片厂和华邈中药工程技术开发中心。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
2 对照提取物的制备取甘草药材10 kg粗粉碎，10倍量水加热回流提取2次，每次3 h，合并提取液浓缩至约20 L，按照1 BV·h-1的速度上用水处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱（35 cm×100 cm，树脂用量约5 kg），收集流出液，用HPLC检测，证明无渗漏，吸附完全；静置吸附24 h，分别以60 L的纯水，80 L的70%乙醇按照3 BV·h-1的速度洗脱，收集70%乙醇洗脱部分。采用多级闪蒸器对收集的洗脱液进行浓缩，进样流速约为10 L·h-1，浓缩2次，得到浓缩液15 L，加热浓缩至体积为5 L，相对密度约为1.2（50 ℃），经喷雾干燥得到对照提取物粉末。
分别用购自北京康仁堂药业有限公司、双桥燕京饮片厂和华邈中药工程技术开发中心制备的各1批甘草药材（10 kg）制得对照提取物粉末分别为570 g（tqw 01）、500 g（tqw 02）、580 g（tqw 03）。
3 对照提取物的基本属性及薄层色谱研究3批对照提取物均为棕色细粉，味微甜。易溶于水，能溶于70%乙醇，水分依次为5.2%、4.1%、5.5%；灰分为3.3%、1.6%、1.5%。
取1 g提取物溶于30 mL水中，用正丁醇提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用水洗3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，即得供试品溶液。另取芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草苷元和甘草酸铵的对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的混合对照品溶液，分别吸取上述供试品溶液1 µL及混合对照品溶液3 µL，点于同一GF254薄层板（正相板）上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）为展开剂；再点于同一RP-18 F254s薄层板（反相板）上，以乙腈-乙醇-水-甲酸（1:1:2:0.05）为展开剂；展开，晾干，分别置紫外光灯（254 nm）下观察。样品在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图 1。
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1.混合对照品，由上至下依次为甘草苷、芹糖异甘草苷、芹糖甘草苷和甘草酸（mixed reference substances，up to down：liquiritin，isoliquiritin apioside，liquiritin apioside and glycyrrhizic acid）2.混合对照品，由上至下依次为芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草苷元和甘草酸（mixed reference substances，up to down：liquiritin apioside，liquiritin，isoliquiritin apioside，liquiritingenin and glycyrrhizic acid）3-5.对照提取物tqw 01-03（licorice reference extract tqw 01-03） 图 1 甘草对照提取物薄层色谱图（A：正相薄层；B：反相薄层） Figure 1 TLC chromatograms of licorice reference extract(A:normal phase TLC; B:reversed phase TLC) |
采用Phenomenex Luna C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0~8 min，0→19%A；8~18 min，19%A→35%A；18~33 min，35%A；33~38 min，35%A→55%A），流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长237 nm，进样量10 µL。
4.2 方法学验证在稳定性试验中，供试品溶液5个共有峰在24 h内保留时间RSD均小于0.3%，峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液及方法的稳定性良好。在精密度试验中，对照品溶液6次进样之间5个特征峰保留时间RSD均小于0.2%，峰面积RSD均小于3%，表明本方法的精密度良好。在重复性试验中，6份样品之间5个共有峰保留时间RSD均小于0.3%，峰面积RSD均小于3%，方法的重复性良好。
4.3 特征图谱的确定通过比较3批甘草对照提取物的HPLC图谱中共有峰，并与药材图谱进行比较，发现了9个共有峰，见图 2、图 3。由于峰4与一杂峰重合，不能完全分离，峰6、7、8较小，故最终确定特征峰为5个。经对照品指认，峰1为芹糖甘草苷，峰2为甘草苷，峰3为芹糖异甘草苷，峰4为甘草素，峰5为甘草酸。以甘草酸为S峰，计算特征峰1-4的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内，规定值为0.32（峰1）、0.35（峰2）、0.48（峰3）、0.58（峰4）。
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图 2 3批对照提取物及药材共有峰 Figure 2 The common peaks of 3 batches of licorice reference extract and Radix et Rhizoma glycyrrhizae |
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图 3 甘草对照提取物特征图谱 Figure 3 Characteristic chromatogram of licorice reference extract |
取各对照品适量，分别以70%乙醇制成含芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷各60 µg·mL-1，含甘草苷、甘草酸各20 µg·mL-1的混合溶液，摇匀，即得。
5.2 供试品溶液的制备取甘草对照提取物粉末50 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，经0.45 µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
5.3 色谱条件采用“4.1”项下的色谱条件，同时对芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸4个成分进行含量测定。采用多波长检测，芹糖异甘草苷的检测波长为360 nm，芹糖甘草苷、甘草苷和甘草酸的检测波长为237 nm。
5.4 方法学验证 5.4.1 线性关系考察精密吸取“5.1”项下混合对照品溶液0.5、1、5、10、15、20、30 µL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸的回归方程：
| $Y{\rm{ = 8}}{\rm{.460}}X - {\rm{5}}{\rm{.825}}\quad r{\rm{ = 0}}{\rm{.999 1}}$ |
| $Y{\rm{ = 17}}{\rm{.84}}X - {\rm{0}}{\rm{.003}}\quad r{\rm{ = 0}}{\rm{.999 9}}$ |
| $Y{\rm{ = 25}}{\rm{.93}}X{\rm{ + 0}}{\rm{.466}}\quad r{\rm{ = 0}}{\rm{.999 9}}$ |
| $Y{\rm{ = 5}}{\rm{.191}}X{\rm{ + 0}}{\rm{.965}}\quad r{\rm{ = 0}}{\rm{.999 9}}$ |
结果表明芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸进样量分别在0.0325~1.95、0.011 5~0.690、0.033 5~2.01、0.106 5~6.39 µg范围内线性关系良好。
5.4.2 检测限和定量限的测定将“5.1”项下混合对照品溶液稀释至一系列的低浓度，精密吸取10 µL注入液相色谱仪，记录4种成分的信噪比（S/N）。检测限和定量限分别是信噪比为3和10时所对应的浓度，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸检测限依次为1.03、0.20、0.07、0.51 µg·mL-1，定量限依次为3.43、0.68、0.21、1.68 µg·mL-1。
5.4.3 精密度试验取tqw01样品的供试品溶液1份，按照“5.3”项下色谱条件连续进样6次，测得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸色谱峰峰面积的RSD（n=6）分别为2.0%、0.7%、0.6%、0.5%，表明仪器精密量良好。
5.4.4 重复性试验取tqw01样品，按照“5.2”项下方法制备6份供试品溶液，按照“5.3”项下色谱条件进行测定，芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸的平均含量（n=6）分别为7.3%、4.9%、2.0%、19.9%，RSD分别为1.9%、1.9%、0.6%和0.5%。表明该方法重复性良好。
5.4.5 稳定性试验取tqw01样品的供试品溶液1份，分别于之制备后0、2、4、8、12、24 h按照“5.3”项下色谱条件进样测定，结果芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸色谱峰面积的RSD（n=6）分别为2.0%、1.6%、0.5%、0.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
5.4.6 加样回收率试验取已知含量的tqw01样品约25 mg，精密称定，平行6份，精密称定，精密加入混合对照品溶液（精密称取芹糖甘草苷对照品19.42 mg，甘草苷对照品12.58 mg，芹糖异甘草苷对照品6.74 mg，甘草酸铵对照品5.84 mg，置同一100 mL量瓶中，用70%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，即得）10 mL，按“5.2”项下方法制备供试溶液，按“5.3”项下色谱条件，进样测定各成分的量，计算回收率，结果芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸的平均回收率（n=6）分别为101.5%、101.7%、98.9%、100.9%，RSD分别为2.1%、1.6%、1.3%、1.6%。
5.5 提取物含量测定结果分别称取3批甘草提取物样品，按照“5.2”项下方法制备供试品溶液，照“5.3”项下色谱条件测定，采用外标法计算提取物中芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草酸的含量，结果见表 1。
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表 1 提取物含量测定结果（%，n=2） Table 1 Content of 4 components in reference extract |
3个厂家提供的不同来源的各10 kg药材，由北京康仁堂药业有限公司和北京中医药大学中试车间分别完成提取工作，3批提取物得率分别为5.7%、5.0%、5.8%，验证了提取物工艺的可行性及稳定性。
6.2 提取物干燥方法选择提取物浓缩液的干燥曾选用冷冻干燥方法，由于制备量不能满足要求及一次干燥耗时过长等原因，未选用冷冻干燥方法，选择了喷雾干燥的方法。
6.3 提取物薄层色谱研究情况文中建立的对照提取物正相薄层方法，对中国药典“甘草”项下方法进行了改进，简便易行，易于检视；建立的反相薄层色谱，斑点清晰，与高效液相色谱具有良好的一致性，实际应用中具有快速检验的功能。
6.4 特征图谱色谱条件的优化对色谱仪（Waters 2 690、Shimadzu LC-20A、Agilent 1260液相色谱仪），色谱柱[Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Shiseido MGII C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Techmate C18-STII（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Pre-C18（250 mm×4.6 mm 5 μm）]、柱温（25、30、35和40 ℃）及流速（0.8、1.0和1.2 mL·min-1）的耐用性进行考察，结果规定的各特征峰的相对保留时间均符合要求，说明该色谱条件具有良好的耐用性。
6.5 对照提取物的应用研究本文应用制备得到的对照提取物对不同厂家的小儿止咳糖浆[16]进行了甘草的含量测定研究，并与对照品定量方法做了比较研究，验证了该对照提取物替代对照品进行定量的可行性。
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