2017, Vol. 37 
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. National Institutes for Food and Drug Control, Bei'jing 100050, China
钙镁片是一种增强骨密度、预防骨质疏松的保健食品，也是目前使用较多的一类保健食品，其功效指标为钙和镁。钙镁片同时含有钙和镁，是由于钙和镁同时参与肌肉的收缩与放松、神经系统的传递及骨骼的健康[1-3]。仅单独补充钙或镁，若一方摄取过高，则会抑制另一方的吸收。因此钙镁片同时提供2种矿物质，以达到均衡补充的原则。目前钙镁的测定方法主要有火焰原子吸收法[4-8]、络合滴定法[9-11]、电极法[12-13]、电感耦合等离子体质谱法[14]、离子色谱法[15]等。其中以火焰原子吸收法使用较多，该方法对钙镁片的预处理一般采用干法和湿法消解，二者的耗时较长，还易使某些被测元素损失，且该方法曲线范围窄，钙镁片样品需经多步稀释，较容易引入误差。本实验所建立的方法是以阳离子为目标检测物，样品不需要进行消解，经阳离子交换色谱柱分离，能够有效地检测到待测溶液中钙镁离子，适用于基质相对复杂的保健食品样品中钙、镁离子的测定，且目前尚未见该类报道。实验结果表明，该方法可以准确而快速地测定保健食品钙镁片中钙、镁离子的含量，且适用性强。
1 仪器、试样 1.1 仪器Dionex ICS-5000离子色谱仪（配Dionex AS自动进样器、四元梯度分析泵、淋洗液发生器、检测器/色谱单元、电导检测器、CSRS® 300 4-mm抑制器、Chromeleon 6.80 SR9色谱工作站，ThermoFisher公司）；IonPac CS12A阳离子交换色谱柱（4 mm×250 mm；填料：乙基乙烯基苯交联55%的二乙烯基苯大孔树脂，键和羧酸-膦酸功能基；Thermo公司），ZonePac® CG12保护柱（4 mm×50 mm；填料：乙基乙烯基苯交联55%的二乙烯基苯大孔树脂，键和羧酸-膦酸功能基；Thermo公司）；Milli-Q超纯水机（密理博公司）；Mettler Toledo MS105DU分析天平（十万分之一，梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试剂、样品钙单元素标准溶液[GBW（E）080118，1 000 μg·mL-1]，中国计量科学研究院提供；镁单元素标准溶液[GBW（E）080126，1 000 μg·mL-1]，中国计量科学研究院；钾单元素标准溶液[GBW（E）080125，1 000 μg·mL-1]，中国计量科学研究院提供；钠单元素标准溶液[GBW（E）080127，1 000 μg·mL-1]，中国计量科学研究院提供；锰单元素标准溶液[GBW（E）080157，1 000 μg·mL-1]，中国计量科学研究院提供；水中铵离子成分分析标准物质[GBW（E）080525，1 000 μg·mL-1]，中国计量科学研究院提供；碳酸钙（99.99%），阿拉丁工业公司；碳酸镁（99.99%），阿拉丁工业公司；甲基磺酸（≥99%），Fluka公司；盐酸，优级纯，国药集团化学试剂有限公司；N2（99.99%），济南德洋特种气体有限公司；超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）。样品1：贝兴牌钙镁片，广东长兴生物科技股份有限公司，批号PGM785627；样品2：鸿洋神牌钙镁片，威海百合生物技术股份有限公司，批号11025009；样品3：采森牌钙镁维D片，南昌市草珊瑚生物技术有限公司，批号20150707；样品4：三也真品钙镁片，深圳市三也生物科技有限公司，批号20140201；样品5：全星牌钙镁锌咀嚼片：山东正奇生物制品有限公司，批号20130521。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：IonPac CS12A阳离子柱（4 mm×250 mm）；保护柱：ZonePac® CG12柱（4 mm×50 mm）；淋洗液：20 mmol·L-1甲基磺酸水溶液：流速0.8 mL·min-1；抑制器：CSRS® 300 4-mm；抑制电流：60 mA；检测器：电导检测器；氮气流速（压力）：35 kPa；柱温：30 ℃；进样量：25 μL。
2.2 供试品溶液的制备取待测样品20片，研细，混匀，精密称取适量（0.3~0.5 g），置250 mL量瓶中，加0.5 mol·L-1盐酸溶液15 mL溶解，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。同时制备试剂空白溶液，考察所用试剂是否对钙、镁离子的测定产生干扰。
2.3 系列标准溶液配制准确量取钙单元素标准溶液2 mL及镁单元素标准溶液1 mL，置100 mL量瓶中，以水定容至刻度，摇匀，即得混合标准溶液；准确移取混合标准溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，制成含钙离子分别为1、2、4、8、16、20 mg·L-1及含镁离子分别为0.5、1、2、4、8、10 mg·L-1的系列混合标准溶液。
2.4 线性关系考察及检出限测定取系列混合标准溶液，按照色谱条件依次进样分析，以钙、镁离子的质量浓度（mg·L-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得钙离子和镁离子的线性方程：
| $ \begin{align} & Y\text{=0}\text{.272}X\text{-614}\ \ r\text{=0}\text{.999}\ \text{8} \\ & Y\text{=0}\text{.442}X\text{-0}\text{.511}\ \ r\text{=0}\text{.999}\ \text{7} \\ \end{align} $ |
表明钙离子、镁离子质量浓度分别在1~20 mg·L-1及0.5~10 mg·L-1范围内线性关系良好。以空白加标样品信噪比等于3（S/N=3）计算钙离子及镁离子的检出浓度分别为0.002和0.001 mg·L-1；信噪比等于10（S/N=10）计算钙离子和镁离子的定量浓度分别为0.006和0.003 mg·L-1。
2.5 精密度试验按“2.2”项下方法制备供试品溶液，连续6次测定，记录各组分峰面积，计算钙离子和镁离子峰面积的RSD分别为0.71%和0.57%，表明精密度良好。
2.6 重复性试验按“2.2”项下制备同一批号钙镁片的供试品溶液6份进行测定，记录峰面积，根据当日的随行标准曲线计算钙离子和镁离子含量，其RSD分别为1.2%和1.8%，表明该方法的重复性良好。
2.7 加样回收率试验取钙镁片（钙离子、镁离子含量分别为13.6%和5.21%）样品0.3 g，精密称定，分别加入碳酸钙0.10 g、碳酸镁0.055 g，制备6份加标样品，按“2.2”项下方法制备加标样品待测溶液进行分析，根据当日的随行标准曲线，分别计算加标样品的测得浓度，求得钙离子、镁离子的回收率分别为99.1%（RSD=1.9%）和99.4%（RSD=2.0%）。
2.8 系统适用性试验考察在本文色谱条件下，钙、镁离子与钠、钾、铵、锰离子分离情况。分别准确量取上述6种离子的标准溶液1、0.5、0.5、1、2、1 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，测定。结果显示，各离子均能达到基线分离，且分离度大于1.5，如图 1所示。
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1.钠离子（sodium ion）2.铵离子（ammonium ion）3.钾离子（potassium ion）4.镁离子（magnesium ion）5.锰离子（manganese ion）6.钙离子（calcium ion） 图 1 6种阳离子分离情况 Figure 1 Separation of six cation ions |
按上述实验方法对5批钙镁片样品进行测定，记录峰面积，按标准曲线法定量，结果以钙离子、镁离子计，同时采用国家标准GB/T 5009.92及GB/T 5009.90以火焰原子吸收法分别测定钙离子、镁离子含量，检验结果见表 1。
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表 1 样品中钙镁离子含量测定结果（%） Table 1 Analytical results of calcium ion and magnesium ion in samples |
钙、镁离子普遍存在于自然界中，试剂的选择尤其重要，特别是实验用水。因此，本实验考察了试验条件下所用试剂对钙、镁离子测定的影响，包括实验用水及盐酸。结果显示，Milli-Q超纯水机所制的超纯水（电阻率为l8.3 MΩ·cm）及国药集团化学试剂有限公司优级纯的盐酸，在相应的保留时间范围内，均不出峰，对钙、镁离子的测定不产生干扰，如图 2所示。
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1.镁离子（magnesium ion）2.钙离子（calcium ion） 图 2 标准溶液、供试品溶液、空白溶液离子色谱图 Figure 2 Ion chromatograms of standard solution, sample solution and blank solution |
本实验分别考察了IonPac CS12、CS14、CS12A 3种离子交换功能基为弱酸的阳离子交换色谱柱，填料均为乙基乙烯基苯交联55%的二乙烯基苯大孔树脂，但树脂上键和的功能基不同，分别为羧酸、羧酸、羧酸-膦酸，三者的柱容量也有所区别，因此会影响离子在色谱柱上的保留行为。以上述3种色谱柱分别测定钠、铵、钾、镁、钙、锰离子混合溶液，考察系统适用性。采用20 mmol·L-1的甲磺酸作为淋洗液，CS14柱存在着钙、镁离子保留时间短，且与钾离子分不开的现象。CS12与CS12A相比，CS12A是一款高容量阳离子交换色谱柱，更适用于快速等度分离各种样品中锂、钠、铵、钾、镁、钙等离子，且该柱子的离子交换基团除了羧基之外加入了膦酸基，增加了二价离子Ca2+和Mg2+的选择性。因此，本实验选择IonPac CS12A作为分析柱。该色谱柱可以选择甲磺酸作为淋洗液，实验过程中考察了10、15、20、25 mmol·L-1甲磺酸对钙、镁离子的分离效果。结果显示，20 mmol·L-1的甲磺酸作为淋洗液即可实现钙、镁离子的有效分离，且出峰时间适中。同时考察了该色谱条件下，钙、镁离子与钠、钾、铵、锰离子分离情况。结果显示，各离子均能达到基线分离，且分离度大于1.5。
3.3 样品处理方法的优化目前申报的钙镁片多以碳酸钙及碳酸镁为原料，淀粉及硬脂酸镁等为辅料，经混合、制粒、干燥、压片等工艺制成的具有补充钙、镁功能的保健食品。本处理方法仅针对以碳酸钙及碳酸镁为原料的样品。综合考虑原料与辅料的化学特性，采用一定浓度的稀盐酸为溶解介质。IonPac CS12A阳离子交换色谱柱可承受高达50 mmol·L-1的H+的供试品溶液进样，因此在保证样品中的钙、镁离子充分解离的情况下，应控制供试品溶液的酸度符合色谱柱的使用要求。本实验采用0.5 mol·L-1的盐酸作为溶解介质，待样品完全溶解后，以水定容，再经10倍稀释后进样，以满足色谱柱的使用要求。样品经该方法处理后的测定结果与硝酸硝化后的测定结果基本一致。另外，辅料硬脂酸镁在保健食品片剂中的最大使用量为每1 kg 0.8 g（即0.08%），硬脂酸镁中镁离子的含量在4.0%~5.0%；因此，在整个配方中硬脂酸镁对镁离子含量的贡献＜0.004%，对镁离子含量的影响可以忽略。
3.4 方法的优势保健食品钙镁片是具有增加骨密度功效的一类保健食品，其中钙、镁离子是该类保健食品的标志性成分，应严格加以控制。目前常用的法定测定方法包括火焰原子吸收法及络合滴定法。火焰原子吸收法测定钙、镁离子时，曲线浓度较低且范围较窄，较适用于微量样品的测定，而保健食品中钙、镁离子的含量多在10%左右，需多步稀释才能进入曲线范围，容易引入较大的误差。滴定法虽然定量准确，但是钙、镁离子同时存在，络合滴定无法区分二者，因此不适用于该类保健品的测定。本实验采用离子色谱法测定保健食品钙镁片中钙、镁离子的含量，前处理方法能够有效游离出钙、镁离子，操作简单、快速，曲线范围宽，测定结果准确，且与火焰原子吸收法分析结果无明显差异，具有一定的使用价值。
| [1] |
周月婵, 胡怡秀, 胡余明, 等. 含钙镁D的某壮骨片增加骨密度作用动物实验研究[J]. 中国热带医学, 2006, 6(8): 1368. ZHOU YC, HU YX, HU YM, et al. Experimental study on the effect of bone -strengthening tablet in strengthening the bone density in animals[J]. China Trop Med, 2006, 6(8): 1368. |
| [2] |
钱聪, 张志瑜, 戴国钧, 等. 高氟区氟铜钙镁锌对骨龄延迟的交互作用研究[J]. 中国医科大学学报, 1993, 22(3): 114. QIAN C, ZHANG ZY, DAI GJ, et al. Interactions of fluoride copper calcium magnesium and zinc on bone-age delay in high fluoride areas[J]. J China Med Univ, 1993, 22(3): 114. |
| [3] |
吴镇, 沈忠林. 浅析糖尿病并发症患者血清镁测定及临床意义[J]. 医学检验与临床, 2007, 18(2): 24. WU ZH, SH ZL. Serum Mg2+ determination in diabetes mellitus patients with complications and its clinical significance[J]. Med Lab Sci Clin, 2007, 18(2): 24. |
| [4] |
许俊博, 刘菲, 王平, 等. 原子吸收分光光度法测定葡萄糖电解质注射液中钙镁钠3种元素的含量[J]. 中国药品标准, 2010, 11(2): 109. XU JB, LIU F, WANG P, et al. Determination of calcium, magnesium, sodium in glucose electrolyte injection by flame atomic absorption spectrometry[J]. Drug Stand China, 2010, 11(2): 109. |
| [5] |
白钰, 欧阳健明, 白燕, 等. 火焰原子吸收光谱法同时测定尿中钙镁[J]. 光谱学与光谱分析, 2004, 24(8): 1016. BAI Y, OUYANG JM, BAI Y, et al. Simultaneous determination of calcium and magnesium in urines by flame atomic absorption spectrometry[J]. Spectrosc Spect Anal, 2004, 24(8): 1016. |
| [6] |
杜钢, 魏伯平, 刘仲义, 等. ASPE-AAS法测定去感热注射液中钙、游离钙与结合钙[J]. 药物分析杂志, 2006, 26(3): 339. DU G, WEI BP, LIU ZY, et al. ASPE-AAS determination of calcium, idssociaitve calcium and combinative calcium in Quganre injeciton[J]. Chin J Pharm Anal, 2006, 26(3): 339. |
| [7] |
刘强, 薛慧, 关坤, 等. 母乳锌、铜、铁、钙、镁测定及意义[J]. 中华妇幼临床医学杂志, 2008, 4(6): 537. LIU Q, XUE H, GUAN K, et al. Measurement of mineral elements contents in breast milk and its significances[J]. Chin J Obstet Gynecol Pediatr, 2008, 4(6): 537. |
| [8] |
朱晨华, 施静文, 冷桃花. 酸及镧盐对钙测定的影响[J]. 光谱实验室, 2012, 9(1): 357. ZHU CH, SHI JW, LENG TH. Influence of acid and lanthanum salt on calcium determination[J]. Chin J Spectrosc Lab, 2012, 9(1): 357. |
| [9] |
中国药典2015年版. 二部[S]. 2015: 1500 ChP 2015. Vol Ⅱ[S]. 2015:1500 |
| [10] |
张贞丽, 袁敏, 高燕, 等. 中药紫石英主成分氟化钙含量测定方法的研究[J]. 药物分析杂志, 2010, 30(3): 495. ZHANG ZL, YUAN M, GAO Y, et al. Study on the determination method of CaF2 in fluoritum[J]. Chin J Pharm Anal, 2010, 30(3): 495. |
| [11] |
龙彦辉, 张永红. 钙镁测定指示剂的研究与应用[J]. 表面技术, 2001, 30(6): 50. LONG YH, ZHANG YH. Development and application of indicator in determining calcium and magnesium[J]. Surface Technol, 2001, 30(6): 50. |
| [12] |
杨有清, 宋四平, 陈栋华. 珍珠水解液中钙离子含量的离子选择电极测定方法[J]. 中南民族大学学报, 2005, 24(1): 10. YANG YQ, SONG SP, CHEN DH. Determination of calcium ion content in pearl solution by ion selective electrode[J]. J South Cent Univ Natl, 2005, 24(1): 10. |
| [13] |
李慧荔, 刘焕云, 苑艳辉, 等. 离子选择性电极法测定食品中钙的含量[J]. 食品与药品, 2005, 7(4): 57. LI HL, LIU HY, YUAN YH, et al. Determination of the calcium content in the food by ion-selective electrode[J]. Food Drug, 2005, 7(4): 57. |
| [14] |
郑华宁, 刘書君, 顾若兰, 等. 电感耦合等离子体质谱法测定尿中钙元素含量[J]. 药物分析杂志, 2009, 29(9): 1525. ZHENG H, LIU SJ, GU RL, et al. Direct determination of calcium in rat urine by inductively coupled plasma mass spectrometry[J]. Chin J Pharm Anal, 2009, 29(9): 1525. |
| [15] |
李苗, 冯光. 离子色谱法测定门冬氨酸钾镁片的含量[J]. 药物分析杂志, 2009, 29(10): 1738. LI M, FENG G. IC determination of potassium aspartate and magnesium aspartate in potassium and magnesium aspartate tablets[J]. Chin J Pharm Anal, 2009, 29(10): 1738. |