2017, Vol. 37 
通脉颗粒是由丹参、川芎、葛根3味中药制成的复方制剂，具有活血通脉的作用，临床用于缺血性心脑血管疾病、动脉硬化、脑血栓、脑缺血、冠心病、心绞痛等[1]。丹参是最常用的活血化瘀中药之一，现代研究表明，丹参的主要水溶性成分丹参素和丹酚酸类化合物具有明显的药理活性，可以保护心肌、抑制血栓形成，对心肌缺血、再灌注损伤具有保护作用，同时对心肌梗死及心肌细胞肥大均有保护作用[2-4]；葛根中的主要有效成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等，它们均属于异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用[5-6]。中国药典2015年版（一部）丹参、葛根项下对丹酚酸B和葛根素进行了含量测定，另外丹参素、原儿茶醛的含量测定已有文献报道[7]。但还未见同时测定通脉颗粒中多种成分的研究，因此，参考已发表文献[8-13]，本文建立了超高效液相色谱法同时测定丹参素、原儿茶醛、葛根素、大豆苷和丹酚酸B的分析方法，为通脉颗粒的质量控制奠定了基础。灰色关联度分析法是灰色系统分析方法的一种，是根据因素之间相似或相异的关系程度（亦即“灰色关联度”），为决策和判断主要因素提供基础[14]。若两因素变化的态势基本一致，则它们之间的关联度较大；反之，关联度较小。经查阅文献可知，近年来灰色关联度分析方法多用于农作物品种的综合评价，未见对中成药质量的综合评价应用。本文以灰色关联度分析方法对丹参素、原儿茶醛、葛根素、大豆苷和丹酚酸B 5种成分的含量测定结果进行综合分析，为通脉颗粒的综合质量评价提供新的方法。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters 2998ACQUITY UPLC系统（PDA检测器），Empower工作站（Waters公司）；XbridgeTM C18色谱柱（4.6 mm×75 mm，2.5 μm；填料：十八烷基键合硅胶；Waters公司）；Sartorius BP211D、Sartorius BP221S电子天平（Sartorius公司）。
1.2 试药对照品丹参素钠（批号110855-201412）、原儿茶醛（批号110810-200506）、丹酚酸B（批号111562-201514）、大豆苷（批号111738-200501）和葛根素（批号110752-201313）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈和磷酸均为色谱纯，水为超纯水。收集了11家企业（甘肃2家、贵州1家、河北3家、湖南1家、重庆1家、吉林3家）生产的52批通脉颗粒，均为有糖型，规格为每袋10 g。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液分别精密称取丹参素钠、原儿茶醛、葛根素、大豆苷、丹酚酸B的对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL含丹参素0.105 9 mg、原儿茶醛0.042 84 mg、葛根素0.192 5 mg、大豆苷0.084 48 mg、丹酚酸B 0.048 30 mg的混合溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液取样品粉末约10 g，研细，精密称定，精密加入70%甲醇50 mL，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性样品溶液分别取按处方自制的缺葛根、缺丹参的阴性样品，按“2.1.2”项下的方法操作，即得。
2.2 色谱条件采用XbridgeTM C18色谱柱（4.6 mm×75 mm，2.5 μm），以乙腈（A）-0.2%磷酸为流动相，梯度洗脱（0~3 min，10%A；3~9 min，15%A；9~20 min，30%A），流速：0.7 mL·min-1，检测波长280 nm，柱温35 ℃，进样量0.5 μL。
取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，在上述色谱条件下进样测定，结果阴性无干扰（图 1）。
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1.丹参素（danshensu）2.原儿茶醛（protocatechuic aldehyde）3.葛根素（puerarin）4.大豆苷（daidzin）5.丹酚酸B（salviamolic acid B） A.混合对照品溶液（solution of mixed reference substances）B.供试品溶液（sample solution）C.缺葛根阴性样品溶液（negative sample solution without Puerariae Lobatae Radix）D.缺丹参阴性样品溶液（negative sample solution without Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma） 图 1 通脉颗粒UPLC色谱图 Figure 1 UPLC chromatograms of Tongmai granules |
分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，在上述色谱条件下分别进样测定。以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。结果见表 1。
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表 1 线性关系 Table 1 Linear relationship |
取同一供试品溶液连续进样6次，测得丹参素、原儿茶醛、葛根素、大豆苷、丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.4%、0.8%、0.4%、0.4%、0.1%。结果表明，仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性考察取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24、48 h进样测定。测得丹参素、原儿茶醛、葛根素、大豆苷、丹酚酸B峰面积的RSD分别为1.0%、1.4%、1.8%、1.2%、1.7%。结果表明供试品溶液中上述5个成分在48 h内稳定性良好。
2.3.4 重复性考察取同一批供试品，平行制备6份供试品溶液，测定，记录各组分色谱峰面积。结果丹参素、原儿茶醛、葛根素、大豆苷、丹酚酸B的含量平均值分别为0.01、0.08、0.32、0.13、0.2 mg·g-1，RSD分别为0.8%、1.2%、1.4%、0.9%、1.5%。
2.3.5 加样回收率试验分别精密称取丹参素钠、原儿茶醛、葛根素、大豆苷、丹酚酸B的对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含丹参素0.250 2 mg，原儿茶醛2.041 5 mg，葛根素7.104 2 mg，大豆苷3.012 5 mg，丹酚酸B 5.153 5 mg的对照品溶液，作为加样回收率试验的对照品加标溶液。
取已知含量的通脉颗粒约5 g，研细，精密称定，共9份，分别每3份加入上述对照品加标溶液各1.0、2.0、3.0 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算加样回收率，结果见表 2。丹参素、原儿茶醛、葛根素、大豆苷和丹酚酸B平均回收率（n=9）分别为99.5%，95.0%，96.8%，97.6%，100.8%。
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表 2 加样回收率试验结果（n=9） Table 2 Recovery results |
取同一供试品溶液，用70%甲醇溶液逐级稀释，进样测定。丹参素、原儿茶醛、葛根素、大豆苷、丹酚酸B的定量限分别为2.5×10-4、4.0×10-3、6.4×10-4、1.3×10-3、1.1×10-3 mg·g-1，信噪比（S/N）分别为11.4、11.8、13.5、12.3、8.0；检出限分别为1.0×10-4、2.0×10-3、3.2×10-4、6.5×10-4、5.5×10-4 mg·g-1，信噪比（S/N）分别为2.4、3.1、3.6、4.0、3.5。
2.4 样品含量测定取所收集的各生产企业的通脉颗粒，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，以外标法计算样品中5个成分的含量（表 3）。
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表 3 不同生产企业通脉颗粒含量测定结果（mg·g-1） Table 3 Determination results of Tongmai granules from different manufacturers |
本试验挑选了3种粒径、柱长度相近的UPLC色谱柱进行试验，分别为XBridgeTM C18（4.6 mm×7.5 mm，2.5 μm；以十八烷基键合硅胶为填料）、Agilent SB-Aq C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm；以十八烷基键合硅胶为填料）、ACQUITY CSH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm；以十八烷基键合硅胶为填料），分离度均符合规定，耐用性良好。
3.2 指标成分的选择本课题为国家评价性抽验课题，样品共计219批，涉及47家生产企业，其中通脉颗粒有糖的剂型为201批，通脉颗粒无糖型为8批，通脉口服液为10批。选取其中有代表性的11个生产企业的52批样品，11个生产企业按企业所在地进行编号。通脉处方中为丹参、葛根、川芎3味药，阿魏酸为川芎主要的水溶性成分，但是利用生产企业提供的3味药材模拟通脉颗粒制法制成溶液进行检测，未检出阿魏酸，可能由于与丹参、葛根的成分发生了反应而转化为其他成分，因此本方法对通脉颗粒中丹参和葛根的成分同时进行分析，采用超高效液相色谱法，分析时间短，方法简单可行。
3.3 相关性分析通过对52批通脉颗粒中5个成分的分析，用SPSS 17.0版软件对其进行相关性分析，结果表明，大豆苷与葛根素的相关系数为0.931，P＜0.01，显著相关；丹参中丹参素与原儿茶醛的相关系数为0.954，P＜0.01，显著相关；丹参素与丹酚酸B的相关系数为0.608，P＜0.01，显著相关；原儿茶醛与丹酚酸B的相关系数为0.568，P＜0.01，显著相关；丹参素与原儿茶醛与丹酚酸B的相关系数较低，可能与丹酚酸B热不稳定有关。
3.4 灰色关联度结果分析本方法对52批的通脉颗粒中丹参和葛根的5个成分的含量测定结果进行灰色关联分析，考察52批样品的综合含量情况，对其质量进行综合分析。灰色关联度法中ri值的计算参照文献[15]中的方法进行，经灰色关联分析得出相对关联度并按ri（s）大小排序，见表7。所有计算使用Excel 2007完成。计算公式如下：
| $ \begin{array}{l} {\xi _i}\left( k \right) = \frac{{\mathop {\min }\limits_i \mathop {\min }\limits_k \left| {{X_0}\left( k \right)-{X_i}\left( k \right)} \right| + \mathop {\rho \max }\limits_i \mathop {\max }\limits_k \left| {{X_0}\left( k \right)-{X_i}\left( k \right)} \right|}}{{\left| {{X_0}\left( k \right)-{X_i}\left( k \right)} \right| + \mathop {\rho \max }\limits_i \mathop {\max }\limits_k \left| {{X_0}\left( k \right)-{X_i}\left( k \right)} \right|}}\\ {r_i} = \sum\limits_{k = 1}^k {{W_k}{\xi _i}\left( k \right)} \end{array} $ |
由相对关联度的含义可知，ri为介于0~1之间的值，因此ri值越接近于1，表明其与最优参考序列的差越小，所评价样品的质量越好。结果显示，生产企业（河北3）的质量最优为0.72，生产企业（吉林1）的质量最差，2批样品均低于0.28。尤其生产企业（吉林1），其中1批样品未检出任何有效成分，其生产工艺及产品质量需要更严格的监控。
3.5 小结通脉方中有3种不同的剂型，有糖型、无糖型及口服液，按照其生药量换算，为15 g生药，其中丹参，葛根，川芎各5 g，由于无糖型及口服液的样品较少，因此本文发表的样品全部为有糖型的通脉颗粒的含量测定结果，其余的无糖型及口服液含量测定的结果表明，大豆苷、葛根素、丹参素钠与原儿茶醛的含量无糖型和口服液含量略高于有糖型，尤其是单酚酸B的含量无糖型的通脉方较高，口服液及有糖型的通脉方单酚酸B含量较低，可能与单酚酸B的热不稳定性有关，但是由于收集的无糖型及口服液样品量较小，不能说明整个市场的情况。通脉方中有效成分的含量可能与其生产工艺有关，生产工艺均为20年前制定，需要进一步的优化，来保证药品的质量有效、可靠。
目前通脉方中现行标准有14种，通脉颗粒涉及9种，其中187批次样品执行《卫生部药品标准》中药成方制剂第四册，标准仅有性状和检查项，存在标准过低，无法全面控制药品质量的问题，导致各生产企业产品质量参差不齐，相对于其他生产企业而言，生产企业（贵州1）的灰色关联度数据在0.58~0.38之间，产品质量较为稳定，且5个成分含量较高。生产企业（甘肃1）中单酚酸B未检出，且丹参中其他的指标成分原儿茶醛及丹参素钠的含量也较低，可能与其丹参的投料量及工艺有关。
本课题针对全国的通脉方中的生产企业的产品质量进行考察，含量测定结果表明，各厂家产品质量参差不齐，需要不断优化生产工艺并保证中药材原料的质量，以保证中成药市场的产品质量可控、有效。
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