钩吻Gelsemium elegans Benth.是马钱科Loganiaceae钩吻属Gelsemium植物,又名断肠草、胡蔓藤、大茶药、野葛等[1],中医理论认为其性温,味苦、辛,有大毒[2],主要分布于浙江、福建、广东、广西等省,以全草入药,其中地上部分因生物量大,可持续采收,目前已成为福建、浙江等地种植户供应的主要药用部位之一。20世纪80年代,临床以钩吻为主要原料的钩吻制剂在各种肿瘤治疗上均取得显著疗效,民间常用,但质量是否一致,即不同产地钩吻化学成分有无差异鲜有报道。钩吻的主要化学成分是吲哚类生物碱,现代药理研究表明其是钩吻抗肿瘤[3-6]、抗炎镇痛[7-11]、增强免疫[12]、散瞳[13]等作用的药效物质基础。查阅文献,目前钩吻质量评价方法已有报道,但是仅仅测定2到3个生物碱的含量,难以全面反映钩吻内在质量[14-15],课题组前期对钩吻进行化学成分分离鉴定研究,从钩吻中分离出16个生物碱,其中6个生物碱即胡蔓藤碱丙(humantenidine)、钩吻素甲(gelsemine)、钩吻素子(koumine)、钩吻素己(gelsenicine)、钩吻绿碱(gelsevirine)、胡蔓藤碱乙(humantenine)分离量最多,提示这6个生物碱是钩吻的主要生物碱成分,化学结构见图 1。
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图 1 钩吻中6个生物碱类成分的结构 Figure 1 Chemical structures of six alkaloids in Gelsemium elegans |
因此,本文采用HPLC法同时测定钩吻中胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙6个生物碱的含量,同时比较这些生物碱在32批不同产地钩吻药材中的含量差异,为钩吻的质量控制、资源评价、安全用药等提供科学的分析方法和依据。
1 仪器与试药安捷伦公司Agilent Technologies 1260高效液相色谱仪(包括G1311C四元泵、G1329B自动进样器、G1315B二极管阵列检测器、G1316A柱温箱和Agilent ChemStation工作站);安捷伦公司Agilent ZORBAX Bonus-RP Analytical色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm;填料:长烷基链中嵌入极性酰胺基团);CPA225D型十万分之一分析天平(Sartorius公司);KQ-500E型台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DFY-500型中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司);Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)。
甲醇、乙腈为色谱纯,甲酸为色谱纯。
对照品胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙均为实验室自制,将各化合物的1H、13C NMR和MS数据与文献[16-21]进行比较确认,以HPLC-UV检测的纯度均大于98.5%。
32批钩吻茎收集于不同产地(见表 3),经福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴定为马钱科胡蔓藤属植物钩吻(Gelsemium elegans Benth.)的干燥茎。
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表 3 样品含量测定结果(n=3) Table 3 The contents of six alkaloids in 32 batches of Gelsemium elegans from different habitats |
色谱柱:Agilent ZORBAX Bonus-RP Analytical(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)溶液,梯度洗脱(0~30 min,2%A→10%A;30~40 min,10%A→15%A);流速:1.0 mL·min-1,;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。在上述色谱条件下,对照品与样品的色谱图见图 2。
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1.胡蔓藤碱丙(humantenidine)2.钩吻素甲(gelsemine)3.钩吻素子(koumine)4.钩吻素己(gelsenicine)5.钩吻绿碱(gelsevirine)6.胡蔓藤碱乙(humantenine) 图 2 混合对照品(A)及样品S19(B)的HPLC色谱图 Figure 2 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and sample S19(B) |
精密称取胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙的对照品适量,分别置于50 mL量瓶中,用甲醇稀释到刻度,摇匀,分别得到质量浓度为200.2、226.0、232.0、232.0、212.0、202.0 μg·mL-1的单一对照品储备液。
2.2.2 供试品溶液药材经粉碎机粉碎,过40目筛。取样品粉末约0.2 g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密加入50%甲醇水(含0.1%甲酸)25 mL,密塞,称量,超声(功率250 W,频率80 kHz)处理30 min,放冷,再称量,用50%甲醇水(含0.1%甲酸)补足减失的量,摇匀,离心(4 000 r·min-1)10 min,过0.22 μm滤膜,取续滤液,即得。
2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系考察取“2.2.1”项下方法制备的各对照品储备液,用50%甲醇水稀释,配成胡蔓藤碱丙质量浓度分别为1.00、2.00、5.01、10.01、20.02、30.03、50.05 μg·mL-1,钩吻素甲质量浓度分别为1.13、2.26、5.65、11.30、22.60、33.90、50.85 μg·mL-1,钩吻素子质量浓度分别为1.16、2.32、5.80、11.60、23.20、34.80、52.20 μg·mL-1,钩吻素己质量浓度分别为1.16、2.32、5.80、11.60、23.20、34.80、52.20 μg·mL-1,钩吻绿碱质量浓度分别为1.06、2.12、5.30、10.60、21.20、30.74、50.88 μg·mL-1,胡蔓藤碱乙质量浓度分别为1.01、3.03、5.05、10.10、30.30、40.40、50.50 μg·mL-1的系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行分析,以质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标,峰面积均值Y为纵坐标,进行回归处理,得到6个分析物的回归方程。以信噪比(S/N)为3:1和10:1为基准测得各化合物的检测限和定量限,结果见表 1。
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表 1 6个成分的线性关系、检测限及定量限 Table 1 Linearity, LOD and LOQ of six alkaloids |
日内精密度:精密吸取混合对照品溶液(胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙质量浓度分别为20.02、22.60、23.20、23.20、21.20、30.30 μg·mL-1)10 μL,在上述色谱条件下连续进样6次,测得胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙峰面积的RSD分别为0.57%、0.17%、0.47%、0.16%、1.2%和0.75%。日间精密度:精密吸取上述混合对照品溶液连续测定3 d,每天测定6次,测得胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙峰面积的RSD分别为0.88%、0.38%、0.73%、0.56%、1.0%和1.1%,结果表明精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取同一供试品溶液(样品编号为S19),分别在制备后0、2、4、10、12和24 h进样10 μL,记录胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙的峰面积,计算得峰面积的RSD分别为1.3%、0.97%、0.33%、0.92%、0.35%和0.38%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.4 重复性试验取同一样品(编号为S19)0.2 g共6份,精密称定,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下进样测定,测得胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙平均含量分别为2.202、1.907、3.178、2.025、2.376、1.778 mg·g-1,含量RSD分别为1.2%、0.34%、0.76%、0.89%、0.65%和1.192%。结果表明重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验取“2.3.4”项下已测知6个成分含量的样品粉末0.1 g共9份,精密称定,每3份加入相同量(分别为已知含量的80%、100%、120%)的胡蔓藤碱丙、钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱和胡蔓藤碱乙的对照品,按“2.2.2”项下方法制备供试溶液,进样测定,计算各待测成分的加样回收率,结果见表 2。
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表 2 加样回收率试验结果 Table 2 Results of recovery tests |
称取干燥的32批不同产地钩吻茎样品粉末0.2 g,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按上述“2.1”项下色谱条件进样10 μL测定峰面积,根据标准曲线计算其含量,结果见表 3。
2.5 聚类分析运用DPS 14.50数据处理软件分析:采用系统聚类法,以6种被测物含量为变量,以卡方距离为指标,对32批钩吻样品进行聚类分析(离差平方和法)分析,得到钩吻样品聚类图,见图 3。当距离介于1.50~2.00时,可以将32个批次分为6类,S1、S12、S17、S21、S23、S24、S26、S31为第1类,S2、S3、S4、S5、S9、S10、S22、S28为第2类,S6、S19为第3类,S7、S8、S14、S15为第4类,S20为第5类,S11、S13、S16、S18、S25、S27、S29、S30、S32为第6类。其中第1、2、3、5、6类中钩吻素子含量最高,其含量范围分别主要集中在2.5~3、1~2.5、3、2.5、3~3.5 mg·g-1,且在第3类中,除钩吻素己外各个化合物的含量均很接近;第4类中钩吻素甲含量最高。因此6类得以区分。
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图 3 聚类分析树状图 Figure 3 The cluster analysis dendrogram |
比较了水、0.1%甲酸水、10%甲醇水、30%甲醇水、50%甲醇水、70%甲醇水、纯甲醇以及相应比例的甲醇水(含0.1%甲酸),结果表明提取溶剂中加入甲酸后各成分含量均有上升,50%甲醇水(含0.1%甲酸)的提取率最高,说明在酸性溶液中,钩吻6个生物碱化合物易呈离子状态,有利于生物碱成分被提取、测定,故选用50%甲醇水(含0.1%甲酸)为提取溶剂;在样品的处理过程中,比较了回流提取法、温浸法、索氏提取法、超声提取法,结果超声提取法的提取率优于温浸法,而与索氏提取法、回流提取法无明显的差异,考虑节省时间和操作方法简单的问题,故选用超声提取法;同时分别考察了超声10、20、30、40 min的提取效果,结果表明从超声30 min后,40 min的提取量并无明显差别,故提取时间选择30 min;采用超声提取法,分别考察了加入250倍、125倍、50倍、32倍量的提取溶剂的提取效果,结果表明250倍、125倍提取量无明显差别,且125倍量的提取量高于其他倍量的提取量,在提取完全的前提下,考虑到节省溶剂的问题,故选择125倍量的提取溶剂进行提取。
3.2 色谱条件的考察罗淑荣等[22]采用HPLC分析钩吻生物碱注射液及其提取物中5个生物碱(分别对应于本文的胡蔓藤碱丙、钩吻素己、钩吻素甲、胡蔓藤碱乙、钩吻素子)的分析方法,其采用甲醇-水-正丁胺体系等度洗脱,钩吻绿碱分离效果不佳,也参考课题组前期研究[15],采用乙腈-0.1%三乙胺体系等度洗脱,6个分析物均无法基线分离,因此重新考察了不同流动相(甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水)对分离和柱效的影响,结果发现样品在甲醇-水、乙腈-水体系中的分离度较差,难以洗脱,但当水中加入一定量的甲酸后6个生物碱能够完全被洗脱和分离,可能由于在酸性环境下促使生物碱解离,易于被洗脱。而在乙腈-0.1%甲酸体系中易出现很强的溶剂峰,且在甲醇-0.1%甲酸水体系中各化学成分均达到基线分离的要求,故最终采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为洗脱系统。
3.3 样品测定结果本实验对32个产地的钩吻茎药材进行含量测定,结果表明,不同产地钩吻茎中6个成分的含量差异较大:从6个成分含量均值来看,含量最高的为钩吻素子,其范围在0.718~3.553 mg·g-1,并且以产地S12、S13、S16含量较高,其次是钩吻绿碱,其含量范围在0.103~3.493 mg·g-1,以产地S13、S25、S27含量较高,而胡蔓藤碱丙、钩吻素己的含量相对最少,含量范围分别在0.125~2.202 mg·g-1和0.076~2.025 mg·g-1,其中,产地S6、S19胡蔓藤碱丙含量远高于其他产地,而产地S19钩吻素己含量远高于其他产地。另外,从6个生物碱成分总和来看,S6、S13、S19 3个产地的生物碱含量最高,达到1.2%以上。
综上,本文建立了HPLC法同时测定钩吻茎中6个生物碱成分的定量分析方法,该方法简便、准确,重复性好,适用于钩吻药材中上述6个生物碱成分的含量测定,为其质量评价提供了科学的实验依据。
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