2017, Vol. 37 
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193
2. Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
地锦草为大戟科植物地锦（Euphorbia humifusa Willd.）或斑地锦（Euphorbia maculate L.）的干燥全草，是中医、维医常用药材，药用价值高，具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄功效，可用于治疗痢疾、泄泻、咯血、尿血，便血、崩漏、疮疖痈肿、湿热黄疸[1-3]。地锦草中化学成分主要是没食子酸、鞣花酸等有机酸类和槲皮素、山柰酚等黄酮类化合物[4-9]。其中，没食子酸具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等活性[10]；鞣花酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变等活性[11]；槲皮素、山柰酚均具有抗炎、抗氧化、抗菌等活性[12-13]。有文献[14]采用UPLC法对其多指标成分同时进行了测定，但其检测时间较长，也有文献采用高效液相色谱法（HPLC）测定了地锦草中1种或多种成分[15-18]。本研究采用UPLC技术，能够在较短的时间内完成对地锦草中没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山柰酚的多成分的同时测定，同时对6个产地地锦草中4个指标性成分的含量差异性进行了比较，采用该方法可以在短时间内更加全面的控制地锦草药材的质量，为地锦草制剂开发及质量控制提供了可靠的依据。
1 仪器、试剂与试药 1.1 仪器Waters Acquity超高效液相色谱仪，配置四元高压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱、PDA检测器；Waters公司Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm；填料：亚乙基桥杂化颗粒）色谱柱；成都超纯科技有限公司优普超纯水机；上海顶帅电器有限公司LD-T100型中草药粉碎机；Mettler Toledo仪器有限公司Mettler AB265-S电子分析天平。
1.2 试剂与试药槲皮素（批号100081-200907）对照品由中国食品药品检定研究院提供；没食子酸（批号140226）、鞣花酸（批号160519）、山柰酚（批号160310）对照品由上海融合医药有限公司提供，质量分数均≥98%。甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为屈臣氏去离子水。地锦草药材共6批，经中国医学科学院药用植物研究所李海涛副研究员鉴定。药材信息见表 1。
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表 1 6批地锦草药材信息 Table 1 The information of 6 batches of Euphorbiae Humifusae Herba |
采用Waters Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，以0.2%磷酸水（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0~2 min，5%B→18%B；2~5.5 min，18%B→40%B；5.5~8 min，40%B），流速0.2 mL·min-1，检测波长271 nm（0~2 min，检测没食子酸）、254 nm（2~6 min，检测鞣花酸）和360 nm（6~8 min，检测槲皮素、山柰酚），柱温30 ℃；进样量为1 μL。
2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液精密称取没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山柰酚的对照品适量，加80%甲醇溶液制成质量浓度分别为没食子酸1.098 mg·mL-1、鞣花酸2.485 mg·mL-1、槲皮素0.458 mg·mL-1、山柰酚0.504 mg·mL-1的混合对照品储备液；精密量取混合对照品储备液1.00 mL，置10 mL量瓶中，用80%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液称取地锦草粉末（过3号筛）约2.0 g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，加入80%甲醇溶液50 mL，称量，加热回流1.5 h，放冷，再称量，用80%甲醇溶液补足减失的量，摇匀，滤过，移取续滤液20 mL，加入25%盐酸溶液7 mL，置85 ℃水浴中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.3 系统适用性试验分别精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液各1 μL，按“2.1”项色谱条件进样，结果4种被测成分均能达到基线分离，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数以各色谱峰数均超过3 000，峰形较好。UPLC色谱图见图 1。
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1.没食子酸（gallic acid）2.鞣花酸（spent acid）3.槲皮素（quercetin）4.山柰酚（kaempferol） 图 1 混合对照品（A）和6号样品（B）的UPLC色谱图 Figure 1 UPLC chromatograms of reference substances(A) and sample No. 6(B) |
精密量取“2.2.1”项下混合对照品储备液0.6、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mL，分别置10 mL量瓶中，加80%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，制得系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程。结果见表 2。
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表 2 回归方程和线性范围 Table 2 Regression equations and linear ranges |
取“2.2.1”混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，测得没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山柰酚峰面积的RSD分别为0.45%、0.85%、0.72%、0.55%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验取待测地锦草（编号6）的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”项色谱条件进样测定，测得没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山柰酚峰面积的RSD分别为0.77%、0.50%、0.98%、1.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验取同一批次地锦草药材（编号6）粉末约2.0 g共6份，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测得没食子酸、鞣花酸、槲皮素、山柰酚的平均含量分别为4.175、9.782、2.429和2.014 mg·g-1，其RSD分别为0.98%、1.6%、0.85%、1.0%，表明方法重复性良好。
2.8 加样回收率试验取已知含量的地锦草药材（编号6）粉末1.0 g共6份，精密称定，每份精密加入“2.2.1”项下混合对照品储备液4 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下条件测定，结果见表 3，表明回收率符合要求。
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表 3 4个成分加样回收率试验结果 Table 3 The results of recovery test of the investigated compounds |
取收集于不同产地的6批地锦草药材，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行2份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，并通过回归方程计算样品中4种指标成分的含量，结果见表 4。
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表 4 样品含量测定结果（mg·g-1，n=2） Table 4 Determination results |
结果表明，不同产地6批次的地锦草药材中，4种指标成分的含量存在一定差异，其中山柰酚的含量差异较大，有3批次的山柰酚含量没有达到检测限，其他3种指标性成分差异并不十分显著，且以安徽产地（批号100821）含量最高，这可能与土壤、环境、采收季节、加工过程等有关。
3 讨论中药的最大特点是其成分具有多样性和复杂性，无论是单味药还是复方，都是多种化学成分的一个集合体，故以单一指标成分控制中药质量显然不足以表明其整体信息。而多指标成分同时进行定量，可准确控制其质量，以保证有效性成分的稳定性和其药理活性。
选择色谱流动相时，分别对有机相（甲醇、乙腈）和水相（纯水、甲酸水、磷酸水）的不同组合进行了考察，结果显示乙腈-0.2%磷酸酸水作为梯度洗脱流动相，能够使色谱峰达到完全分离，可以在较短的时间内实现基线分离。
在样品处理过程中，分别对甲醇、80%甲醇溶液、50%甲醇溶液3种溶剂的提取效率进行了研究，同时对超声提取和回流提取方法进行了考察，结果显示当选择80%甲醇溶液回流提取1.5 h时提取效果最佳。测定波长的选择上，没食子酸的最大吸收为271 nm，鞣花酸的最大吸收波长为254 nm，槲皮素、山柰酚均在360 nm时有最强吸收，并且基线平稳，故确定其测定波长为0~2 min时波长为271 nm，2~6 min时波长为254 nm，6~8 min时波长为360 nm。
本文通过UPLC法建立了快速测定地锦草中4种指标成分的方法，该方法分离效果理想，重现性好。与其他文献报道的方法比较，可大大缩短分析时间，并提高分析效率，文中对6个产地的地锦草指标性成分的含量进行了含量差异性的比较，表明不同产地地锦草中指标性成分含量差异较大，为地锦草药材的质量控制提供了理论依据。
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