2017, Vol. 37 
2. 广东天然药物研究与开发重点实验室, 湛江 524023;
3. 广东医学院附属医院药学部, 湛江 524023
2. Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs, Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China;
3. Dept. of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524023, China
洛伐他汀（lovastatin）作为羟甲基戊二酰单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，已普遍用于临床治疗高胆固醇血症。近年来的研究表明，他汀类药物除降血脂的作用外，还可抑制HMG-CoA向甲基二羟戊酸转变。甲基二羟戊酸在胞质内一系列酶催化下生成异戊烯焦磷酸、焦磷酸法尼酯、焦磷酸香叶酯等多种对细胞功能起重要作用的产物[1]。洛伐他汀可抑制肿瘤细胞焦磷酸法尼酯和焦磷酸香叶酯的合成，阻止关键信号传导蛋白Ras的法尼基化和Ras超家族小分子Rho GTPase的香叶酯化会影响它们作为信号传递分子在亚细胞的定位和功能，从而影响其细胞周期的进展[2-3]和细胞侵袭转移的相关能力[4-5]。项目组前期工作发现，洛伐他汀可有效抑制人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞的侵袭、趋化运动和粘附能力，阻滞细胞于G0/G1期，使G2/M期、S期的细胞明显减少，从而有效抑制癌细胞的体外增殖，且呈剂量和时间依赖性，提示洛伐他汀可作为潜在的抗肿瘤转移药物[6-7]。为进一步阐明洛伐他汀的作用机制，本研究进一步探讨洛伐他汀对人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞的抑制作用与Ras/NF-κB信号通路的关系。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料与试剂HO-8910PM细胞株购自上海细胞生物所；洛伐他汀（Sigma公司；实验前用DMSO溶解，RPMI-1640培养液（Gibco公司）稀释，DMSO终体积浓度为0.1%（实验证明该体积浓度对细胞无影响），洛伐他汀浓度分别为4、8、16、32 µmol·L-1）；小牛血清（杭州四季青工程有限公司）；Plasma Membrane Protein Extraction Kit（Biovision公司）；ECL试剂、ERK2兔IgG多抗、NF-κB小鼠IgG单抗、ⅠκB-α兔IgG多抗、VEGF兔IgG多抗（Santa Cruz公司）；Ras小鼠IgG单抗（Oncogene公司）；HIF-1α兔IgG多抗（博士德公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG（北京中杉公司）；100 bp DNA marker（Takara公司）；琼脂糖（Biowest公司）；RT-PCR试剂盒（Qiagen公司）；Trizol（上海生工生物工程技术公司）；Propidium Iodide、RNase A、NP-40（上海华舜生物工程有限公司）；[γ-32P]ATP（北京福瑞生物工程公司）。
1.2 细胞培养HO-8910PM细胞培养于含10%小牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的RPMI-1640完全培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度孵箱培养。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度至2×105 ·mL-1，分装于60 mm培养皿中，每皿5 mL。待细胞贴壁后根据前期实验结果[6]，加入相应浓度的洛伐他汀溶液50 µL，空白组加入等量的PBS，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养48 h。
1.3 RT-PCRTrizol试剂盒提取细胞总RNA，之后逆转录合成cDNA。由上海生物工程有限公司设计并合成PCR扩增引物。VEGF：F 5’-CGAAACCATGAACTTTCTGCTGTC-3’，R 5’-TCACCTCCT-CGGGCTTGTCACAT-3’，扩增片段452 bp；K-Ras：F 5’-CAAATCACATTTATTTCCTAC-CAG-3’，R 5’-ACTGAATATAAACTTGTGGTA-GTTGG-3’，扩增片段356 bp；HIF1α：F 5’-AAACCACCTATGACCTGC-3’，R 5’-GTCGTGCTGAATAATACCACTC-3’，扩增片段408 bp；RhoA：F 5’-CTGGTGATTGTTGGTGA TGG-3’，R 5’-GCGATCATAATCTTCCTGCC -3’，扩增片段183 bp；NF-κB（P65）：F 5’-TCAATGGCT ACACAGGACCA-3’，R 5’-CACTG-TCACCTGGAA GCAGA-3’，扩增片段307 bp；GAPDH：F 5’-ACCAC AGTCCATGCCAT-CAC-3’，R 5’-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3’，扩增片段452 BP；GAPDH：F 5’-ACG-GATTTGGTCGTATTGGG-3’，R 5’-TGATTTTG GAGGGATCTCGC-3’，扩增片段231 BP。反应条件：95 ℃，15 min；重复（94 ℃ 0.5 min、48~58 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min）35个循环，72 ℃，延伸10 min。产物进行电泳分析，紫外透射仪观察结果并拍照。相片经扫描仪扫描后，用图像分析软件Bandscand进行光密度积分值分析，计算出VEGF、K-Ras、HIF-1α、RhoA、NF-κB（P65）分别与内参照GAPDH的光密度积分值之比作为它们的相对含量值。
1.4 Western Blot收集细胞，冰PBS洗2次，1×107个细胞加入100 µL预冷至0 ℃的NP-40细胞裂解液裂解，置于碎冰上间歇超声破碎（0.5 s/0.5 s，400 W，30 min），4 ℃、12 000×g离心15 min。将上清液，即细胞总蛋白。按Applygen公司的核-胞浆蛋白制备试剂盒说明书操作提取核蛋白和胞浆蛋白，按Biovision公司的Plasma membrane protein提取试剂盒提取膜蛋白。参照Bradford酶标板蛋白定量法[33]定量蛋白浓度。按试剂盒说明书及相关步骤，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜上，Western blot膜快速封闭液封闭20 min，电化学发光法（ECL法）显示结果，压片曝光，显影定影后扫描。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件Bandscan 4.5进行光密度积分值分析。以山羊多克隆抗体检测细胞骨架蛋白Actin，以保证上样的一致性。
1.5 统计学分析本实验数据资料用x±s表示，SAS 8.0评估版统计软件进行单因素方差分析。P < 0.05表示差异有显著意义，P < 0.01表示差异有非常显著意义。
2 结果 2.1 洛伐他汀对人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞Ras、HIF-1α、NF-κB（p65）、RhoA、VEGF mRNA表达的影响不同浓度（4、8、16、32 µmol·L-1）的洛伐他汀溶液分别作用于HO-8910PM细胞48 h，用RT-PCR的方法检测Ras、NF-κB（p65）、VEGF、HIF-1α、RhoA mRNA表达水平的变化，图像经Bandscan软件进行光密度分析。结果表示：用4~32 µmol·L-1的洛伐他汀分别处理HO-8910PM细胞48 h，与内参照GAPDH比较，洛伐他汀可以使NF-κB（p65）、VEGF和RhoA mRNA的表达水平下降，其中以16 µmol·L-1和32 µmol·L-1组效果显著（P < 0.01），表明洛伐他汀可以抑制HO-8910PM细胞NF-κB（p65）、VEGF mRNA和RhoA的表达；而对K-Ras和HIF-1α mRNA的表达无明显影响（图 1）。
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图 1 洛伐他汀处理HO-8910PM细胞48 h对Ras，HIF-1α，NF-κB（p65），RhoA and VEGF mRNA表达的影响（与对照组比较：*表示P < 0.05，**表示P < 0.01） Figure 1 Effects of lovastatin on the expression of Ras, HIF-1α, NF-κB(p65), RhoA and VEGF mRNA in HO-8910PM cells for 48 h(*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group) |
如图 2所示，与对照组相比，洛伐他汀处理HO-8910PM细胞48 h后，Ras总蛋白的表达无明显变化；但Ras蛋白在胞浆和胞膜之间的分布却发生了明显改变，洛伐他汀16 µmol·L-1和32µmol·L-1组细胞胞浆中Ras蛋白水平明显高于对照组（P < 0.05，P < 0.01），而洛伐他汀16 µmol·L-1和32 µmol·L-1组细胞胞膜中Ras蛋白水平明显低于对照组（P < 0.01）。
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图 2 洛伐他汀处理细胞48 h对Ras蛋白水平的影响（与对照组比较：*表示P < 0.05，**表示P < 0.01） Figure 2 Effects of lovastatin on the expression of Ras proteins for 48 h(*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group) |
不同浓度（4、8、16、32 µmol·L-1）的洛伐他汀溶液作用于HO-8910PM细胞48 h后，Western Blot检测发现，洛伐他汀可以使VEGF、HIF-1α和ERK2蛋白的表达减少，其中以16 µmol·L-1和32 µmol·L-1组效果显著（P < 0.01），表明洛伐他汀可以抑制HO-8910PM细胞内VEGF、HIF-1α和ERK2蛋白水平增高（图 3）。
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图 3 洛伐他汀处理细胞48h对VEGF，HIF-1α和ERK2蛋白表达的影响（与对照组比较：*表示P < 0.05，**表示P < 0.01） Figure 3 Effects of lovastatin on the expression of VEGF, HIF-1α and ERK2 proteins for 48 h(*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group) |
Blot检测胞浆及胞核内NF-κB（p65）和Ⅰ-κBα水平表明：HO-8910PM细胞p65亚基主要存在于胞核内，Ⅰ-κBα主要存在于胞浆中；16 µmol·L-1和32 µmol·L-1的洛伐他汀作用于HO-8910PM细胞48 h后，胞浆内p65蛋白明显高于对照组（P < 0.01），胞浆内Ⅰ-κBα水平明显低于对照组（P < 0.01），而胞核内p65蛋白明显低于对照组（P < 0.05，P < 0.01），胞核内Ⅰ-κBα水平明显高于对照组（P < 0.01）（图 4）。
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图 4 洛伐他汀处理细胞48 h对NF-κB（p65）（A）和Ⅰ-κBα（B）核转位的影响（与对照组比较：*表示P < 0.05，**表示P < 0.01） Figure 4 Effects of LOV on the nuclear translocation of NF-κB(p65)(A) and Ⅰ-κBα(B) in HO-8910PM cells(*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group) |
卵巢癌是严重威胁女性生命健康的妇科恶性肿瘤之一，其致病机制是一个多因素参与的过程。虽然无法确定其确切病因，但目前的研究显示，K-Ras基因突变和慢性炎症过程是卵巢癌发生的早期事件之一[8-10]。突变Ras基因产生的Ras蛋白有极高的传导活性，而这种极高的传导活性在癌变的过程中起着关键作用，而抑制Ras及其下游信号可抑制细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡[11]。洛伐他汀已被发现具有阻断Ras蛋白的法尼基化和Ras超家族小分子Rho GTPase的香叶酯化，从而抑制肿瘤细胞侵袭转移的功能[1]。本研究进一步发现，洛伐他汀尽管对K-RAS的mRNA水平及总RAS蛋白的表达无影响，但其能显著可上调Ras蛋白在HO-8910PM细胞胞浆中的水平，而下调其在胞膜上的蛋白水平，即改变Ras在胞内的分布。同时也发现洛伐他汀下调了Ras信号通路的下游分子VEGF、ERK2、HIF-1α和RhoA等的蛋白表达。这提示了，洛伐他汀可能通过抑制Ras蛋白的法尼基化从而抑制Ras锚定于细胞膜上，使其不能发挥信号转导的生物功能，进而影响其下游分子的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。
NF-κB的激活及细胞凋亡、肿瘤细胞侵袭转移的关键因素，同时也是被Ras所激活的下游分子。有研究指出，当机体存在致癌性Ras时，炎症刺激可启动NF-κB信号通路参与的正反馈环路，最终导致Ras活性被放大，从而产生慢性炎症或演变成癌[12]。而NF-κB的激活也依赖于Ⅰ-κBα，NF-κB活化后迅速刺激大量Ⅰ-κBα重新合成。新合成的Ⅰ-κBα在核内与NF-κB结合使其自DNA上脱离，并通过Ⅰ-κBα末端富含亮氨酸的出核序列（nuclear export seqence，NES）与CRM1/ex2portinl蛋白（NES受体）识别，将NF-κB·Ⅰ-κBα复合物转运出核，由此构成一个精密的负反馈调控体系严格调控NF-κB活性[13-14]。本研究发现，洛伐他汀能明显阻断Ⅰ-κBα的出核过程，使Ⅰ-κBα在核内聚集，此过程随着洛伐他汀的浓度升高而逐渐增强。同时，洛伐他汀上调胞浆和下调核内的NF-κBp65蛋白表达，这种趋势同样呈现剂量依赖关系，这说明洛伐他汀同样能抑制NF-κB往核内转录的功能。因此，推测洛伐他汀能影响核膜脂质结构，损伤NES与CRM1/ex2portinl蛋白的功能活性，导致Ⅰ-κBα出核受抑，使核内NF-κB·Ⅰ-κBα复合物增多，从而抑制NF-κB诱导的靶基因转录，而起促凋亡的作用。这充分表明了洛伐他汀抑制人高转移卵巢癌HO-8910PM细胞增殖和诱导凋亡作用的分子机制与阻断Ras/NF-κB通路密切相关。
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