2017, Vol. 37 
2. 北京中医药大学中医药研究院, 北京 100029;
3. 北京中医药大学图书馆, 北京 100029
2. Beijing Research Institution of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
3. Library of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
苦碟子，为菊科苦荬菜属抱茎苦荬菜Ixeris sonchifolia（Bunge）Hance的全草[1]，具有清热[2]、凉血活血[3]、消肿排脓[2]等功效。苦碟子中的化学成分种类繁多，主要含黄酮、倍半萜内酯、三萜皂苷和有机酸等化合物[4-6]。其中倍半萜内酯类化合物广泛存在于菊科、八角科及木兰科[7-9]等多植物中，是多种药用植物的重要活性成分。近年来国内外研究表明，倍半萜内酯类成分在强心[10]、抗肿瘤[11-12]、抗炎、抑菌[13]等方面均具有较好的生物活性。苦荬菜内酯Z（Ixerin Z）和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z（11，13α-dihydroixerin Z）成分为苦碟子中2种重要的倍半萜内酯类成分。药物与血清蛋白结合率是药物代谢动力学的重要参数之一，影响药物在体内的作用规律[14-16]。本实验室采用高速逆流色谱分离技术[17]从苦碟子中首次分离得到苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z，并采用平衡透析法结合HPLC技术研究苦荬菜内酯Z，11，13α-二氢苦荬菜内酯Z与牛血清白蛋白（BSA）的结合率，为其药物动力学研究提供参数，对研究该类成分在体内的药理效应强度、作用时间有重要的参考意义。
1 仪器与试剂Agilent 1100型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），TARGIN VX-Ⅱ型多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）；Thermo Fresco 21微量离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；梅特勒MS205Dμ分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；TTL-DCI型氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）、Millipore Synergy UV型超纯水机（Millipore公司）。
苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的对照品由实验室自苦碟子药材中分离纯化制得，通过1H-和13C-NMR以及LC-MS等分析并与文献数据对照鉴定结构，采用HPLC面积归一化法测定其纯度均大于98%；透析袋（截留相对分子质量：12 000~14 000；规格：干燥时直径21 mm，每卷长5 m；北京拜尔迪生物技术有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，0.01 mol·L-1；北京拜尔迪生物技术有限公司）；BSA标准品（纯度≥98%；美国Sigma公司）；甲醇为色谱纯，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 溶液配制 2.1.1 对照品储备液分别精密称取苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的对照品储备液，备用。
2.1.2 BSA溶液精密称定BSA适量，加PBS溶液制得1 mmol·L-1的BSA溶液，备用。
2.1.3 样品溶液精密量取苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的对照品储备液适量，用甲醇分别逐级稀释，配制成质量浓度分别为0.36、1.56、3.12 mg·mL-1和0.48、1.82、3.6 mg·mL-1的对照品溶液，分别精密量取上述2个化合物的3种不同浓度对照品溶液各100 μL，置1.5 mL离心管中混合，并加入PBS或BSA溶液1 mL，涡旋60 s，取上清即得2个化合物的低、中、高3个浓度混合溶液，即苦荬菜内酯Z（0.03、0.13、0.26 mg·mL-1）和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z（0.04、0.16、0.30 mg·mL-1）的PBS样品溶液或BSA样品溶液（模拟经过透析平衡后的透析袋外或内样品溶液）。
2.1.4 供试溶液取PBS样品溶液或BSA样品溶液200 μL，加甲醇600 μL沉淀蛋白，涡旋混合30 s，以8 000 r·min-1离心5 min，取上清液500 μL置于离心管中，氮吹，残渣加200 μL甲醇复溶，涡旋混合30 s，以8 000 r·min-1离心5 min，取上清即得苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的PBS供试溶液或BSA供试溶液。
2.1.5 空白溶液取PBS 200 μL，其余操作同“2.1.4”项下供试溶液制备，即得。
2.2 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0~5 min，30%B→37%B；5~15 min，37%B→52%B；15~22 min，52%B→60%B）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：272 nm。分别取苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z透析袋内外溶液、PBS供试溶液、BSA供试溶液及空白溶液均为10 μL进样。在上述色谱条件下，本试验中苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的PBS及BSA溶液的HPLC色谱图峰形良好，无杂质干扰测定，具有较高的特异性，分析条件可以满足测定。色谱图见图 1。
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1.苦荬菜内酯Z（Ixerin Z）2.11，13α-二氢苦荬菜内酯Z（11，13α-dihydroixerin Z） 图 1 空白PBS溶液（A）、BSA供试溶液（B）、PBS供试溶液（C）、透析袋外样品溶液（D）、透析袋内样品溶液（E）的HPLC图 Figure 1 Chromatograms obtained from blank PBS(A), BSA test solution(B), PBS test solution(C), sample solution outside dialysis bag(D)and sample solution inside dialysis bag(E) |
在BSA溶液的标准曲线：取苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的对照品储备液适量，用甲醇依次稀释得系列对照品溶液，浓度分别为0.04、0.12、0.24、0.52、1.04、1.08mg·mL-1和0.08、0.16、0.32、0.60、1.20、2.40 mg·mL-1。各精密取上述2个化合物系列浓度溶液100 μL于1.5 mL离心管中；另取BSA溶液200 μL共12份，依次加入上述各离心管中，涡旋60 s，分别得到质量浓度分别为0.01、0.03、0.06、0.13、0.26、0.52 mg·mL-1的苦荬菜内酯Z溶液，0.02、0.04、0.08、0.15、0.30、0.60 mg·mL-1的11，13α-二氢苦荬菜内酯Z溶液。按“2.1.4”项下方法制备所需溶液，进样测定；以苦荬菜内酯Z或11，13α-二氢苦荬菜内酯Z浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，分别得到苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的线性方程：
| $\begin{array}{l} \begin{array}{*{20}{c}} {Y = 2.021 \times {{10}^4}X{\rm{ }} + 268.10}&{{r^2} = 0.999{\rm{ }}0} \end{array}\\ \begin{array}{*{20}{c}} {Y = 2.260 \times {{10}^4}X{\rm{ }} + 150.07}&{{r^2} = 0.999{\rm{ }}7} \end{array} \end{array}$ |
在PBS溶液的标准曲线：取苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的对照品储备液适量，用甲醇依次稀释得系列对照品溶液，浓度分别为0.04、0.12、0.24、0.52、1.04、1.08 mg·mL-1和0.08、0.16、0.32、0.60、1.20、2.40 mg·mL-1。各精密取上述2化合物系列浓度溶液100 μL于1.5 mL离心管中；另取200 μL PBS溶液12份，依次加入上述各离心管中，涡旋60 s，得到质量浓度分别为0.01、0.03、0.06、0.13、0.26、0.52 mg·mL-1的苦荬菜内酯Z溶液，0.02、0.04、0.08、0.15、0.30、0.60 mg·mL-1的11，13α-二氢苦荬菜内酯Z溶液。按“2.1.4”项下方法处理制备所需溶液，以苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，分别得到苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的线性方程：
| $\begin{array}{l} \begin{array}{*{20}{c}} {Y = 2.177 \times {{10}^4}X - 29.96}&{{r^2} = 0.999{\rm{ }}7} \end{array}\\ \begin{array}{*{20}{c}} {Y = 2.260 \times {{10}^4}X - 29.47}&{{r^2} = 0.999{\rm{ }}1} \end{array} \end{array}$ |
结果表明，在BSA溶液和PBS溶液中，苦荬菜内酯Z质量浓度在0.01~0.52 mg·mL-1的线性范围内线性关系良好，方法的定量下限为0.01 mg·mL-1；11，13α-二氢苦荬菜内酯Z质量浓度在0.02~0.60 mg·mL-1的线性范围内线性关系良好，方法的定量下限为0.02 mg·mL-1。
2.3.2 准确度与精密度试验按“2.1.4”项下方法分别制备低、中、高3个浓度的PBS和BSA的供试溶液，每个浓度平行制备6份，进行HPLC分析，以当日随行标准曲线计算供试溶液中2个化合物的实测浓度，分别计算苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z在BSA和PBS溶液中的准确度（相对偏差，RE）。按“2.1.4”项下方法制备低、中、高3个浓度的PBS和BSA的供试溶液，每个浓度平行制备6份，在1 d内及连续3 d用同台仪器进行HPLC分析，根据峰面积计算日内和日间精密度（RSD），结果见表 1。
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表 1 准确度和精密度（n=6） Table 1 Intra-and inter-day accuracy and precision |
按“2.1.4”项下方法制备低、中、高3个浓度的PBS和BSA的供试溶液，每个浓度平行制备6份，于室温下保存，分别于0、2、6、10 h进行HPLC分析。以当日随行标准曲线计算苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z在BSA和PBS供试溶液的浓度；结果在BSA溶液中，苦荬菜内酯Z低、中、高3个浓度的RSD分别为2.49%、5.45%、3.37%，11，13α-二氢苦荬菜内酯Z低、中、高3个浓度的RSD分别为2.50%、2.52%、2.69%；在PBS溶液中，苦荬菜内酯Z低、中、高3个浓度RSD分别为2.98%、4.24%、1.35%，11，13α-二氢苦荬菜内酯Z低、中、高3个浓度RSD分别为2.79%、2.40%、1.83%。结果表明，2个化合物在BSA和PBS溶液中室温下放置10 h基本稳定。
2.3.4 透析时间的确定采用平衡透析法原理，在透析袋内装入1 mL PBS溶液，结扎透析袋两端使不漏液，将透析袋置于盛有10 mL含苦荬菜内酯Z（0.03、0.13、0.26 mg·mL-1）和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z（0.04、0.15、0.30 mg·mL-1）的PBS溶液的离心管中，使袋内外液面处于同一水平高度，每个浓度平行做3份。在37℃水浴中透析，在9、12、24 h于透析袋两侧分别取样，参照“2.1.4”项下方法处理并测定透析袋内、外的苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z质量浓度，以两者质量浓度比值确定两者从袋内外自由扩散达到平衡的时间，结果见表 2。结果表明两化合物24 h已透析完全。
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表 2 透析时间的确定（n=3） Table 2 The determination of dialysis time |
参照“2.3.4”项下实验方法操作，在37℃水浴透析，24 h 2个化合物透析达到平衡后，于透析袋两侧分别取样，参照“2.1.4”项下方法处理，根据参考文献[18]并以标准曲线法，计算透析袋外2个化合物的浓度，求得吸附率，结果见表 3。结果表明，透析袋对2个化合物有微弱的吸附，该吸附量可忽略不计。
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表 3 透析袋对苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的吸附率（n=3） Table 3 The adsorption rate of Ixerin Z and 11, 13α-dihydroixerin Z by dialysis membrane |
精密量取1 mL BSA溶液代替1 mL PBS溶液加入透析袋中，参照“2.3.4”项下实验方法操作，在37℃水浴透析至24 h平衡后，使用10%（v/v）高氯酸溶液检查透析袋外PBS溶液中有无蛋白漏出，若有浑浊出现说明此袋泄露，实验数据作废[19]。取透析袋外和透析袋内溶液各200 μL，按“2.1.4”项下方法处理，分别测定苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z袋内BSA溶液中的质量浓度（总浓度Dt）及袋外PBS溶液中苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的质量浓度（游离浓度Df），按血浆白蛋白结合率=（Dt-Df）/Dt×100%，计算2个化合物的BSA结合率，结果见表 4。
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表 4 苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的BSA结合率的测定（n=3） Table 4 The binding rates of Ixerin Z and 11, 13α-dihydroixerin Z with bovine serum albumin |
平衡透析法具有原理简单，操作简便等特点，是目前进行化合物蛋白结合率测定的常用方法。本文首次采用平衡透析法对苦碟子中倍半萜内酯类成分苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的单体与BSA的结合率进行了测定。本实验采用透析温度为37℃，通过对透析时间的考察，最终确定了2个化合物透析平衡时间为24 h的条件，同时采用10%高氯酸溶液检查透析结束后透析袋外PBS溶液中无蛋白漏出，表明所建立的方法适用于苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z的BSA结合率的测定。
本实验结果表明，苦荬菜内酯Z和11，13α-二氢苦荬菜内酯Z与BSA具有中等强度的结合率，且在实验浓度内BSA结合率与PBS中药物浓度无关。稳定的血浆蛋白结合率，使发挥药效作用的游离型药物质量浓度保持相对稳定，同时血浆蛋白结合具有可逆性，当游离型药物因组织分布而质量浓度下降时，结合型药物与蛋白解离，补充到组织中，从而有利于药效的持续充分发挥。
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