前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）是一种激肽释放酶样的丝氨酸蛋白酶，相对分子质量为33 kD，由237个氨基酸残基组成；主要由前列腺腺泡及导管上皮细胞分泌产生。虽然PSA因为较好的器官特异性，和较差的疾病特异性，在前列腺癌的鉴别诊断中饱受争议^[1-2]，但目前在临床实践中，联合检测血清中总前列腺特异性抗原（total prostate specific antigen，tPSA）和游离前列腺特异性抗原（free prostate specific antigen，fPSA）以及PSA相关导出参数和动力学参数如PSA速率、PSA倍增时间等^[3-4]均依赖于tPSA的检测，在前列腺癌的鉴别诊断、疗效监测、预后观察等方面均具有较大的价值^[5]。因此PSA的准确定量具有重要意义。本研究制备了第5批免疫测定用PSA国家标准品，对其进行了标定并对均匀性和稳定性做了评价，在联合定值的过程中，根据检测技术的发展，使用了检测灵敏度更高的化学发光法、时间分辨免疫荧光法和微粒子酶免疫检测法进行定值，以全自动仪器为主，使该标准品的应用范围更广，拟用于定量检测tPSA的试剂盒的质量控制和评价。

1 仪器、试剂与材料 1.1 主要仪器

IMMULITE 2000 XPi化学发光免疫分析仪（西门子医学诊断产品（上海）有限公司）；ADVIA Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪（西门子医学诊断产品（上海）有限公司）；ARCHITECT i2000 sr全自动免疫分析仪（雅培贸易（上海）有限公司）；Elecsys 2010电化学发光全自动免疫分析仪（罗氏诊断产品（上海）有限公司）；BHP9507化学发光免疫分析仪（日本滨松株式会社）；ANYTEST2000时间分辨荧光分析仪（苏州新波生物技术有限公司）；MICROLAB^®540B分液仪（瑞士Hamilton公司）；CPA225D电子天平（赛多利斯公司）；LYO-13冻干机（上海东富龙科技有限公司）。

1.2 试剂与材料

PSA-ACT复合物（PSA-ACT Complex）（PSA质量浓度：134.6 μg·mL^-1；Biospacific公司，批号：PAK16）；PSA国际标准品（PSA-fPSA（90:10），英国国家生物标准与检定所（NIBSC），96/670，1 μg），即tPSA国际标准品；fPSA国际标准品（NIBSC，96/668，1 μg）；氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠均为分析纯。

PSA测定试剂盒（化学发光法）、fPSA测定试剂盒（化学发光法），来自西门子医学诊断产品（上海）有限公司、罗氏诊断产品（上海）有限公司、强生（上海）医疗器材有限公司、贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司、北京源德生物医学工程有限公司，其中分别使用了西门子医学诊断产品（上海）有限公司用于Immulite系统和Centaur系统的2种试剂盒。

PSA测定试剂盒（时间分辨免疫荧光法）、fPSA测定试剂盒（时间分辨免疫荧光法），来自苏州新波生物技术有限公司和广州市达瑞生物技术股份有限公司。

tPSA测定试剂盒（微粒子酶联免疫检测法）、fPSA测定试剂盒（微粒子酶联免疫检测法），雅培贸易（上海）有限公司产品。

2 方法与结果 2.1 国家标准品的制备

以蒸馏水配制0.02 mol·L^-1 PBS；称取牛血清白蛋白（BSA）20 g，溶解到2 000 mL PBS中，配制成1%的BSA基质液；准确量取PSA-ACT复合物原料2.95 mL，以BSA基质液稀释，并定容至1 100 mL，配制质量浓度为360 ng·mL^-1的溶液；用分液器分装，0.5 mL·支^-1，委托吉林省食品药品检验所冻干，即得。

2.2 国家标准物质的标定 2.2.1 标定方案

标准物质含量标定及均匀性和稳定性检验使用了目前国内市场上已获得产品注册证书的8个公司的8种PSA检测试剂盒和5种fPSA检测试剂盒，其中国产试剂盒3种，进口试剂盒5种，涉及化学发光法、时间分辨免疫荧光法和酶联免疫法3种分析方法。

将PSA国际标准品和fPSA国际标准品用样本稀释液配制成100、75、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 ng·mL^-1 8个浓度的溶液，使用不同的PSA试剂盒分别检测上述PSA和fPSA样本并将测定结果进行比对，效价比（potency ratio，PT，即各浓度样本实测浓度与理论浓度比值的平均值）符合要求范围（PT在0.8~1.2之间）时，认为该试剂盒有效，可用于后续的定值试验，经检测，其中一种试剂盒对PSA与fPSA检测比对结果的PT为1.610 7，被剔除，不参与后续的检测。

根据预实验结果，设定待标定国家标准品PSA含量为90 ng·支^-1，将其用0.5 mL蒸馏水复溶并配制成100、75、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 ng·mL^-18个质量浓度的溶液，用同一试剂盒对PSA国际标准品和国家标准品进行测定并将结果进行比对，计算国家标准品的PSA含量。国家标准品中fPSA的含量以同样方案进行，配制质量浓度为6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 ng·mL^-1的溶液。上述每个样本均重复测定2次，记录浓度值和信号值。

2.2.2 数据处理与定值

以中国食品药品检定研究院开发的体外诊断试剂结果统计分析软件分别对国际标准品PSA-国家标准品PSA进行两条直线斜率的t检验及PT^[6]计算。各试剂盒的数据结果显示，两直线斜率t检验均无差异，即两条直线平行，PSA检测结果的PT值如表 1所示，均值为1.050 7，SD为0.070 2，依据拉依达准则^[7]，数据均可纳入计算，因此国家标准品PSA标定浓度为180×1.050 7=190 ng·mL^-1，相当于95 ng·支^-1，赋值不确定度u₁²=0.004 928。

同样的方法，预实验估计fPSA浓度约为3.2 ng·mL^-1，有5种试剂盒参与了国家标准品fPSA含量的标定，其中1组数据t检验t＞t_0.05（5）（t=7.223，t_0.05（5）=2.571），P＜0.05，剔除，其余4组数据PT值分别为0.993 4、1.064 8、0.859 4和0.919 1，均值为0.959 2，因此国家标准品fPSA标定浓度约为3ng·mL^-1，相当于含量为1.5 ng·支^-1。

2.2.3 均匀性检验

使用tPSA定量测定试剂盒（电化学发光法）（检测范围为0.003~100 ng·mL^-1）、fPSA测定试剂盒（电化学发光法）（检测范围为0.010~50 ng·mL^-1），根据标准物质均匀性检验的取样原则，随机抽取20支样品，均制成50 ng·mL^-1溶液，其中19支每支测定1次，1支连续测定19次，结果见图 1，瓶间精密度为0.98%，计算瓶间精密度不确定度分量u₂²=0.000 097，通过方差分析法得到F值1.10，根据自由度（1，17），F_0.05为3.59，因此F＜F_0.05，样品分布均匀。

2.2.4 不确定度的分析

按表 2中的3个不确定度分量，按公式 ${u_c} = \sqrt {u_1^2 + u_2^2 + u_3^2} $ ，计算合成不确定度（u_c），取包含因子k=2，则扩展不确定度U=190×0.142 1=27 ng·mL^-1。

2.2.5 稳定性检验 2.2.5.1 冷藏稳定性

随机取PSA国家标准品分别在4℃放置1、2、3、4、5、7、9、11周，将上述标准品复溶稀释，PSA质量浓度为75、50、25、12.5、6.25ng·mL^-1，fPSA质量浓度为3.0、1.18、0.789、0.393、0.2 ng·mL^-1，用试剂盒分别检测tPSA和fPSA浓度，将-80℃保存的国家标准品复溶稀释后做平行比对，4℃与-80℃保存标准品检测结果PT值结果见图 2，4℃保存1~11周，与-80℃保存的标准品比较，PSA检测结果均在标准品定值的不确定度范围内，经t检验直线斜率︱b₁︱＜t_0.95，6^*S（b₁）（b₁=0.000 35，t_0.95，6=2.447，S（b₁）=0.006 086）^[7]，因此认为4℃保存11周，标准品是稳定的。

2.2.5.2 加热稳定性

随机取PSA国家标准品在37℃放置1、2、3、4、5、7、9、11周，稀释方法同“2.2.5.1”项方法，以-80℃放置的国家标准品做平行比对，PT值结果见图 3，经t检验直线斜率︱b₁︱＞t_0.95，6^*S（b₁）（b₁=-0.011 46，t_0.95，6=2.447，S（b₁）=0.002 2），37℃放置11周，随着放置时间的延长，tPSA显著降解，fPSA浓度显著升高，因此该标准品37℃存放不稳定，应避免高温存放。

2.2.5.3 长期稳定性

该标准品标定试验1年后，取-80℃保存的PSA国家标准品，按“2.2.1”“2.2.2”项的方法，使用5种PSA测定试剂盒检测，PT值为1.122 6、1.170 4、0.954 0、1.118 8和0.950 4，均值为1.063 24，PSA修正浓度为180×1.063 24=191 ng·mL^-1，在定值不确定度波动范围内。

3 讨论

PSA主要存在于男性精液中，具有生物学活性的PSA经酶解后失去活性，在血液中以fPSA存在。而少量进入循环系统的活性PSA主要与α₁-抗糜蛋白酶（PSA-ACT）、α₂-巨球蛋白酶（PSA-AMG）、α₁-蛋白酶抑制剂等结合，以结合状态存在，避免其酶活性存在的破坏作用，正常生理情况下，前列腺体与血液系统之间的组织屏障限制PSA的流动，血中PSA浓度极低且相当稳定。当肿瘤或其他病变破坏此屏障时，可导致外周血PSA水平升高^[9]。目前获批上市的tPSA试剂盒检测到的实际上是fPSA与PSA-ACT之和。

本次换批制备的PSA国家标准品，以PSA-ACT为原料，但其含量在冻干后降低近50%，说明冻干过程可能对PSA-ACT稳定性有较大影响，导致其结构破坏，另外，在后期的标定中，有少量的fPSA被检出，可能来源于PSA-ACT的分解。目前，该类试剂盒的性能评价主要参考医药行业标准YY/T 1163-2009《总前列腺特异性抗原（tPSA）定量测定试剂（盒）（化学发光免疫分析法）》，本次制备的PSA标准品中，fPSAP的含量偏低，因此配对分子的等克分子反应性项目需要联合使用fPSA对试验样品进行配制，配制过程中同时也应考虑该标准品中fPSA的含量。

标准物质是具有准确量值的测量标准^[10-11]，此前中国食品药品检定研究院的免疫测定用前列腺特异性抗原国家标准品在相关产品的研发、标准制定、产品性能验证和市场监管中发挥了重要作用，本次换批制备，沿用了以往的制备方法和工作经验，根据可获得的参考测量程序和参考物质情况，确定了量值传递方案^[12]，使用了世界卫生组织认可的来源于NIBSC的PSA和fPSA国际标准品进行量值传递，联合了符合纳入标准的市场占有率较高的8个试剂盒生产厂商进行了标准品的赋值，满足标准品的定值要求。

在定值过程中，探索性分析了不确定度产生的来源，包括国际标准品、协作标定过程以及均匀性引入的不确定度因素，初步估计了定值的不确定度；均匀性检验表明样品分布均匀；稳定性检验表明样品在-80℃冷冻条件下可长期稳定保存，在冷藏条件下可稳定保存至11周，但在高温条件下易分解，因此应避免高温存放。

根据国家食品药品监督管理总局数据查询，目前我国已批准上市的国产和进口（总）前列腺特异性抗原检测试剂盒接近40种，主要以化学发光法、酶联免疫法和时间分辨荧光免疫分析法为主，本次制备的PSA国家标准品在定值过程中，使用了多种方法学和检测系统进行评价，可适用于不同的免疫检测平台，为行业标准的贯彻实施提供实物标准品保障，其制备和发放将有助于我国PSA试剂盒生产企业对其相关产品进行准确赋值，为纸质标准的实施提供实物标准的支持^[13-15]，为试剂盒的注册和上市后监管提供科学有力的保证。