氢醌和苯酚可以抑制黑色素生成，达到祛斑美白的效果，因美白祛斑效果明显，价格低廉，曾被广泛添加到美白祛斑类化妆品中，但这2种成分具有较大的皮肤刺激性，确切的心血管疾病和白血病致病性^[1]，我国《化妆品卫生规范》（2007年版）将其列为祛斑美白类化妆品的禁用成分^[2]。近年来，国家对化妆品安全性监督力度逐年加强，但仍有祛斑美白化妆品中检出违禁使用氢醌、苯酚，因此，对祛斑美白类化妆品中氢醌、苯酚的监测不可放松。

《化妆品卫生规范》（2007年版）指定的氢醌、苯酚的检验方法包括气相色谱法和高效液相色谱法^[3-4]，其中液相色谱法应用最为广泛。作者在实际检验中发现，用甲醇-水系统做流动相，对供试品溶液中多种成分洗脱能力均较强，易出现峰拖尾、峰前沿、馒头峰和宽峰等现象，干扰测定。本文对高效液相色谱法测定化妆品中氢醌、苯酚的色谱柱类型、流动相组成和pH进行了比较，并对国家安全监督抽检的200余批次市售美白、祛斑类化妆品进行了检验，以期为化妆品检验标准的改进提供基础，为国家化妆品安全监督工作提供技术支持。

1 仪器与试药 1.1 仪器

赛默飞Ultimate 3000高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；色谱柱：岛津Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），沃特世XBridge Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），沃特世XTerra MS C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），波士顿Green ODS-AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），资生堂CAPCELL PAK C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；昆山市超声仪器公司KQ-250DB超声波清洗仪；梅特勒公司Xs105型电子分析天平；IKA公司MS3 digital涡旋混合仪；Thermo公司X1R高速冷冻离心机。

1.2 试药

氢醌和苯酚对照品，德国Dr.Ehrenstorfer，纯度99.5%；干扰样品为自制，取甲醇-水色谱系统中有干扰的化妆品样品17批，等比例混合制得；样品均为市售，剂型包括面膜、化妆水、乳液、霜膏及洗面奶。所有试剂均为色谱纯；试验用水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液

精密称取氢醌和苯酚的对照品适量，分别用甲醇溶解并配制成质量浓度为1.0 mg·mL^-1的对照品储备溶液；精密吸取氢醌对照品储备溶液0.4 mL及苯酚对照品储备溶液0.7 mL于10 mL量瓶中，以甲醇定容，即得氢醌和苯酚质量浓度分别为40和70 μg·mL^-1的混合对照品储备溶液，再以甲醇稀释配制氢醌质量浓度分别为0.4、2.0、8.0、20和40 μg·mL^-1及苯酚质量浓度分别为0.7、3.5、14、35和70 μg·mL^-1的系列混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

称取样品1.0 g于10 mL比色管中，加甲醇至刻度，涡旋混匀，超声（功率400 W，频率40 kHz）提取20 min，冷却至室温，取提取液2 mL于离心管中，8 000 g离心10 min，上清液用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液即得。

2.2 色谱条件优化 2.2.1 色谱柱考察

本文比较了磷酸盐-磷酸缓冲溶液为水相及甲醇为有机相时，氢醌、苯酚及干扰样品在色谱柱A[Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）]、色谱柱B[XBridge Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]、色谱柱C[ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）]、色谱柱D[XTerra MS C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）]、色谱柱E[Green ODS-AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）]、色谱柱F[CAPCELL PAK C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）]6种色谱柱上的色谱行为。为保证结果的可比性，通过调整梯度洗脱条件使氢琨和苯酚在不同色谱柱上的保留时间相近，并兼顾氢醌、苯酚与样品的分离效果。由表 1可知，各色谱柱对氢醌和苯酚的分离效率均能满足要求，理论板数大于3 000 m^-1；在色谱柱B上氢醌为前沿峰，苯酚为拖尾峰，拖尾因子分别为0.73和1.16；在色谱柱C上苯酚为拖尾峰，拖尾因子1.21；在色谱柱D上氢醌和苯酚均为拖尾峰，拖尾因子分别为1.35和1.53；在色谱柱A、E和F上，氢醌、苯酚均能得到对称性较好的色谱峰，拖尾因子0.9~1.1。氢醌在6种色谱柱上的峰面积无明显差异，在色谱柱E和F上的峰高明显大于其他色谱柱；苯酚在色谱柱A上的峰面积明显较小，在色谱柱B、E和F上的峰高明显较大。

此外，还比较了干扰样品在6种色谱柱上的分离情况。在色谱柱B、C和E上，有一杂质峰和氢醌峰的保留时间相近，调整洗脱条件无法使两峰分离度大于1.5；在色谱柱D上，有一杂质峰和苯酚峰的保留时间相近，调整洗脱条件仍得不到较好的分离。色谱柱A和F上氢醌、苯酚均能与杂质峰得到有效分离，分离因子大于1.5，但是色谱柱A上氢醌和苯酚的响应偏低，实际检验中会导致样品的检出浓度较高，易造成漏检出问题。因此，色谱柱F[CAPCELL PAK C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）]为最适用色谱柱。

2.2.2 缓冲盐种类考察

比较流动相中引入乙酸铵或磷酸二氢钾对氢醌、苯酚及样品色谱行为的影响。在流动相系统中加入乙酸铵或磷酸二氢钾对氢醌、苯酚的色谱行为无影响，但能显著改善化妆品样品的色谱行为，磷酸盐系统的效果稍优于乙酸铵系统。加入盐的浓度为10 mmol·L^-1或20 mmol·L^-1的分离效果无明显差别。因此，选择10 mmol·L^-1磷酸二氢钾水溶液为水相。

2.2.3 流动相pH考察

考察水相pH为2.5、3、3.5、4、5、6时氢醌、苯酚及干扰样品的色谱行为，结果见表 2。随着流动相pH降低，色谱柱的分离效率降低，对氢醌、苯酚分离的理论板数逐渐变小，拖尾因子先靠近1再远离1，峰面积和峰高先增大再减小，在pH 3~4之间时拖尾因子、峰面积和峰高较优。干扰样品在氢醌色谱峰前有干扰成分峰，当流动相pH大于等于4时其色谱峰为明显拖尾峰且与目标峰无法实现基线完全分离，当流动相pH小于4时拖尾得到明显改善且可与目标峰实现有效分离，但pH太低影响色谱峰的稳定性和色谱柱的寿命，因此选择水相的pH为3.5。

2.2.4 色谱条件的确立

色谱柱：CAPCELL PAK C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：10 mmol·L^-1磷酸二氢钾（磷酸调pH 3.5）水溶液-甲醇，梯度洗脱（0~4 min，27%甲醇；4~12 min，27%→60%甲醇；12~14 min，60%甲醇；15~22 min，60%→90%甲醇；23~30 min，90%→27%甲醇）；流速：1 mL·min^-1；柱温：25℃；检测波长：280 nm，进样量：5 μL。

2.3 方法学研究 2.3.1 线性关系考察

取氢醌和苯酚系列混合对照品溶液，在“2.2.4”项色谱条件下进行测定，以质量浓度C（μg·mL^-1）为横坐标，对应的响应面积A为纵坐标进行线性回归。氢醌、苯酚的线性方程：

$\begin{array}{l} \begin{array}{*{20}{c}} {Y = 0.626{\rm{ }}7X - 0.051{\rm{ }}63}&{r = 0.999{\rm{ }}8} \end{array}\\ \begin{array}{*{20}{c}} {Y = 0.364{\rm{ }}1X - 0.027{\rm{ }}25}&{r = 0.999{\rm{ }}9} \end{array} \end{array}$

线性范围分别为0.4~40和0.7~70 μg·mL^-1。以3倍信噪比计算氢醌和苯酚的检测限分别为0.000 5和0.001 μg，定量限分别为0.002和0.003 5 μg。方法的专属性良好，杂质对测定无干扰，见图 1。

2.3.2 精密度试验

配制氢醌质量浓度分别为1.0、12和30 μg·mL^-1，苯酚质量浓度分别为1.75、21和52.5 μg·mL^-1的低、中、高浓度的混合对照品溶液，分别连续进样5次进行测定，考察精密度。结果氢醌、苯酚浓度的RSD分别为0.4%~1.0%和0.3%~1.8%，表明精密度良好。

2.3.3 回收率试验

准确称取阴性样品5份，每份1.0 g，分别精密加入氢醌和苯酚混合对照品储备液适量，按照“2.1.2”项下方法进行处理，制备高、中、低浓度供试溶液，分别在“2.2.4”色谱条件下进行测定，并计算回收率和RSD。结果氢醌、苯酚的平均回收率分别为98.4%~99.5%和100.4%~102.2%，见表 3，回收情况良好。

2.4 样品测定

取抽检的市售美白祛斑产品（剂型涉及面膜、化妆水、乳液、霜膏和洗面奶）200批，分别按照“2.1.2”项下方法进行处理，在“2.2.4”项所述色谱条件下进行测定。在本文的样品处理方法下氢醌和苯酚的检出浓度分别为1和2 μg·g^-1，定量浓度分别为4和7 μg·g^-1。样品色谱图中未出现拖尾峰、馒头峰，干扰峰和目标峰能实现基线分离，分离因子大于1.5。

3 讨论

在定量分析中，HPLC法由于具备准确性、重复性好，普及性高等特点，已经成为首选。色谱条件的系统适用性是评判方法优劣的通用标准，本文以色谱行为参数为指标，考察了色谱柱类型、缓冲盐系统和流动相pH对系统适用性的影响。

3.1 色谱柱

不同色谱柱的填料不同，对化学成分的吸附性会有差异。固定相填料对成分的吸附能力强于流动相的洗脱能力时形成拖尾峰；固定相对成分的吸附能力弱于流动相的洗脱能力时形成前延峰。中国药典规定色谱峰的拖尾因子0.9~1.1为佳，在色谱柱A、E和F上，氢醌、苯酚均能得到对称性较好的色谱峰。氢醌在色谱柱E和F上的峰高明显大于其它色谱柱，而峰面积无明显差异，苯酚在色谱柱A上的峰面积明显较小，在色谱柱B、E和F上的峰高明显较大。此外，干扰样品在色谱柱D上，有一杂质峰和苯酚峰的保留时间相近，调整洗脱条件仍得不到较好的分离；在色谱柱B、C和E上，有与氢醌峰保留时间相近的杂质峰，调整洗脱条件无法使两峰分离度大于1.5。综上，色谱柱A和F均可用于化妆品中氢醌和苯酚的测定，其中色谱柱A对氢醌和苯酚的死吸附较大导致响应偏低。

3.2 缓冲盐种类

当流动相的离子强度较小时，酸性化合物易出现色谱峰太宽、对称性差等峰形问题，加入适合的缓冲盐可改善这一问题^[5]。氢醌和苯酚均为弱酸性成分，在C₁₈色谱柱上的色谱性质比较稳定，流动相的离子强度和pH对其色谱行为影响不会太大^[6-7]。在流动相系统中加入乙酸铵或磷酸二氢钾对氢醌、苯酚的保留时间、峰形和峰面积等无明显变化，但对化妆品样品中杂质峰的峰形有显著的修饰作用，并大大改善了目标峰与干扰峰的分离情况。引入磷酸二氢钾的效果优于引入乙酸铵的效果。

3.3 流动相pH

反相高效液相色谱中，流动相的pH对酸性化合物的分析具有重要意义，不恰当的pH值可能导致峰形不对称、分裂、太宽或肩峰，不同pH条件下目标化合物的保留时间、响应强度及重现性也会有一定差异^[8-9]。化妆品中可能干扰氢醌和苯酚测定的成分如防腐剂、防晒剂、祛斑剂等，高效液相色谱法分析的流动相一般为酸性^[10-12]。随着流动相pH值降低，色谱柱对氢醌和苯酚分离的理论板数逐渐变小，拖尾因子、峰面积和峰高有细微波动^[13-15]，以pH 3~4之间时较优；干扰样品在氢醌色谱峰前有一拖尾峰，当流动相pH小于4时，此干扰峰拖尾得到完全改善，可与目标峰得到有效分离；但pH太低会降低色谱柱的分离效率、缩短的寿命，因此，选择水相的pH为3.5。

美白类化妆品一般包括酸度调节剂、防腐剂、美白剂、防晒剂等多种化学成分，对高效液相色谱法分析的要求也不尽相同。作者在检验中发现，《化妆品卫生规范》给出的以甲醇-水系统为流动相等度洗脱法不能将杂质峰和目标峰有效分离，特别是一些添加了中药提取物的样品；采用梯度洗脱法可使部分样品的杂质峰和目标峰得到分离，但仍有部分化妆品样品存在色谱峰拖尾、宽峰和基线漂移等情况，影响实际测定。

4 结论

研究结果显示，CAPCELL PAK C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）为分离祛斑、美白类化妆品中氢醌和苯酚的优选色谱柱；加入10 mmol·L^-1缓冲盐，调节流动相pH在3~4之间，有效改善了供试品溶液的色谱行为，实现了杂质和目标色谱峰的有效分离。在优化色谱条件下，对市售的化妆品样品200批次进行氢醌、苯酚检测，结果令人满意。