2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 扬子江药业集团质量部, 泰州 225321;
3. Thermo Fisher 公司上海实验室, 上海 201206;
4. 中国药科大学, 南京 210009
2. Yangtze River Pharmceutical Group, Taizhou 225321, China;
3. Thermo Fisher Lab at Shanghai, Shanghai 201206, China;
4. China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China
碘海醇（iohexol）作为第2代非离子型单体造影剂，临床用于血管、腰、胸及颈段脊椎造影，CT增强扫描等。与离子型造影剂比较，由于低渗透性、电性及化学毒性，能降低不良反应的发生率，碘海醇类造影剂相对安全。但是，严重的不良反应仍时有发生[1]，因此，对碘海醇的有关物质的研究和控制就尤为重要。碘海醇中合成反应的最后一步有可能产生两类副产物，分别是O-烷基化合物和N-烷基化合物，目前，碘海醇中包括这两类副产物在内的已知有关物质和未知杂质共约20个，为了保证安全性，各国药典对碘海醇及其注射液中有关物质都有严格的控制要求，检测方法和限度基本相同。对于N-烷基化合物，各国药典均没有明确归属，如存在这类杂质，是作为其他单杂和其他杂质总量进行控制[2]。而对O-烷基化合物一直是标准中控制重点，分别定位并规定限量。由于各国药典和进口药品标准对O-烷基化合物定位或确认方法略有不同[2-3]，检测中常会将N-烷基化合物归属为O-烷基化合物，给结果判断带来一定的困难。
碘海醇分析研究多集中在体内外药物主成分的含量测定[4-12]。除药典收载的方法和测定内、外型异构体的报道外，对碘海醇原料及其注射剂中有关物质的研究尚不多见[13-15]。本文采用LC-MS/MS方法，以高分辨率、高质量精度、高灵敏度和宽动态范围的基于静电场轨道阱（Orbitrap）技术的质谱系统，对保留时间在碘海醇外异构体之后的有关物质的色谱峰进行质谱分析，根据它们的裂解规律，分别将这些有关物质归属为O-烷基化合物或N-烷基化合物（结构见图 1）。研究结论可为药品标准的提高和检测结果的判断提供科学、合理和可靠的依据。
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图 1 碘海醇和有关物质结构式 Figure 1 Structures of iohexol and related substances |
Thermo scientific公司液相色谱-质谱联用仪（Ultimate 3000液相系统，Surveyor自动进样器、二极管阵列检测器、QE Focus质量分析器）；Millipore公司Milli-Q超纯水器；Mettler Toledo公司MX5型电子天平。
1.2 试药碘海醇原料（批号1509014、1509015、1509016等3批）由扬子江药业集团提供。甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯，水为超纯水。
2 实验与结果 2.1 色谱条件色谱系统：Thermo scientific Ultimate 3000液相系统；色谱柱：Sycronis C18（100 mm×2.1 mm，3.0 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；流动相：0.01%甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，按表 1进行梯度洗脱；流速：300 μL·min-1。
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表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program |
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式（scan mode）：正、负离子全扫描；ESI喷雾电压（ESI spray voltage）：+3 800 V/-3 200 V；鞘气压力（sheath gas pressure）：40 arb；辅助气压力（aux gas pressure）：10 arb；毛细管温度（capillary temp.）：320 ℃；加热器温度（heater temp.）：350 ℃。
2.3 供试品溶液制备取3批碘海醇供试品白色粉末各适量，加甲醇使溶解制成每1 mL中约含2 mg的溶液，作为供试品溶液。
2.4 质谱结果分析 2.4.1 总离子流图精密量取供试品溶液5 μL，注入色谱仪，按设定的色谱、质谱条件分离分析，分别采用紫外检测、正负离子模式扫描，记录3批供试品溶液在254 nm波长下的色谱图（纵坐标为峰高，μAU）和正负离子条件下的总离子流图（纵坐标为相对丰度，relative abundance），典型结果见图 2、3。
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图 2 碘海醇及其有关物质在254 nm波长下HPLC色谱图和正离子（+TIC）和负离子（-TIC）模式下的总离子流图（保留时间0.44~60.16 min） Figure 2 HPLC chromatograms(254 nm)and total ion chromatograms in positive(+TIC)and negative(-TIC)ionization modes of iohexol and its related compounds(retention time at 0.44-60.16 min) |
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图 3 碘海醇及其有关物质在254 nm波长下HPLC色谱图和正离子（+TIC）和负离子（-TIC）模式下的总离子流图（保留时间17.9~52.51 min） Figure 3 HPLC chromatograms(254 nm)and total ion chromatograms in positive(+TIC)and negative(-TIC)ionization modes of iohexol and its related compounds(retention time at 17.9-52.51 min) |
分别对主成分碘海醇（其内外异构体）（保留时间约16.30 min）之后的有关物质（保留时间17.09~52.51 min）峰进行质谱分析，记录其正负切换模式下一级正离子质谱图和负离子一级质谱图，结果见图 4。
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图 4 各有关物质正负离子一级质谱图 Figure 4 The primary positive(+)and negative(-)mass spectra of the related compounds |
QE Focus在正负切换模式下均有小于1×10-6质量精度，以C、H、O、N和Ⅰ元素组成，对碘海醇各有关物质峰在正负切换模式下在1×10-6以内拟合，从一级质谱图拟合出元素组成，有关物质1~11均有相同的分子式和相同的相对分子质量（895），得[M+H]+ m/z 895.924 32和[M+HCOOH-H]-m/z 939.915 95的唯一元素组成C22H33O11N3I3和C23H33O13N3I3，由此可知元素组成为C22H32O11N3I3。碘海醇合成反应的最后一步主反应是烷基化反应，如图 5，但是碘海醇的侧链的羟基也会有少量被继续烷基化，生成副产物O-烷基化合物，若侧链的酰胺氮被继续烷基化，则会生成N-烷基化合物。O-烷基化合物和N-烷基化合物有相同分子量，表明有关物质1~11不是O-烷基化合物就是N-烷基化合物。
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图 5 合成碘海醇的烷基化反应 Figure 5 The alkylation reaction for iohexol synthesis |
分别在碰撞能量（CE）=10 eV、CE=30 eV能量下，对碘海醇各有关物质峰进行二级质谱分析，记录其正负切换模式下二级正离子质谱图和负离子二级质谱图。有关物质1（保留时间约19.0 min）结果见图 6~8。
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图 6 有关物质1在CE=10 eV能量下正离子二级质谱图 Figure 6 The secondary positive(+)mass spectrum of the related compound 1 at CE=10 eV |
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图 7 有关物质1在CE=30 eV能量下正离子二级质谱图 Figure 7 The secondary positive(+)mass spectrum of the related compound 1 at CE=30 eV |
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图 8 有关物质1在CE=30 eV能量下正离子二级质谱低质量范围放大图 Figure 8 The secondary positive(+)low mass range spectrum of the related compound 1 at CE=30 eV |
在CE=10 eV能量下，有[M+H]+峰m/z 895.923 46和碎片离子峰m/z 877.912 90，后者经拟合分子式为C22H31O10N3I3。
在CE=30 eV正离子模式下，有碎片离子峰m/z 451.827 36，m/z 374.983 40，有关物质1正离子二级质谱低质量范围有碎片离子峰m/z 148.096 79，m/z 112.075 70，m/z 104.070 58和m/z 86.059 95，由于Focus质量分析器优质的质量精度，可以拟合出正离子碎片组成分别为C11H4O3NI2，C12H12O4N2I，C6H14O3N，C6H10ON，C4H10O2N和C4H8ON。但是，在负离子模式下，由于较小的碰撞能量只生成Ⅰ-，无其他特征离子峰，无法用于碎片鉴定。
用仪器自带的Mass Frontier 7.0质谱软件，对质谱数据进行解析，通过碎裂离子可预测有关物质1的裂解规律如图 9所示。
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图 9 有关物质1的裂解规律 Figure 9 Fragmentation pattern of the related compound 1 |
N-烷基化合物在裂解过程中，碎片离子m/z 877.913 8断裂丢失的碎片成环生成碎片离子m/z 130.086 26，再氢重排生成碎片离子m/z 112.075 69；[M+H]+峰m/z 895.924 4断裂丢失的碎片氢重排生成碎片离子m/z 104.070 60，再成环生成碎片离子m/z 86.060 049。O-烷基化合物无法发生以上重排。根据以上裂解规律，结合精确分子量的测量，从而可以推测有关物质1是N-烷基化合物而不可能是O-烷基化合物。
有关物质2~5（保留时间19.33~26.12 min），和有关物质1有相同的分子式和相同的相对分子质量（895），分别在CE=10 eV、C=30 eV能量下，它们的二级正离子质谱图显示和有关物质1具有相同的碎片，即在CE=10 eV正离子模式下，有[M+H]+峰m/z 895.923 46和碎片离子峰m/z 877.912 90，在CE=30 eV正离子模式下，有碎片离子峰m/z 451.827 36和m/z 374.983 40。同样，在负离子模式下，由于较小的碰撞能量只生成Ⅰ-，无其他特征离子峰。因此推测，有关物质2~5和有关物质1都是N-烷基化合物，分别是不同内-外型异构体（exo-endoisomerism）。
分别在CE=10 eV、CE=30 eV能量下，继续对碘海醇有关物质6~11进行二级质谱分析，记录各峰在正负切换模式下二级正离子质谱图和负离子二级质谱图。在碰撞能量（CE）=10 eV，有关物质6（保留时间约33 min）的二级正离子质谱图见图 10。
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图 10 有关物质6在CE=10 eV能量下正离子二级质谱图 Figure 10 The secondary positive(+)mass spectrum of the related compound 6 at CE=10 eV |
此时，有分子离子峰m/z 895.923 46，碎片离子峰m/z 877.912 90和m/z 803.873 29，后者经拟合分子式为C19H25O8N3I3。用Mass Frontier分析碎片离子m/z 803.873 29匹配机理，可预测有关物质6的裂解规律（A）如图 11所示。
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图 11 预测有关物质6的裂解规律（A） Figure 11 Speculated fragmentation pattern(A)of the related compound 6 |
较之前述的N-烷基化合物，有关物质6更容易形成M+H-C3H8O3碎片离子峰m/z 803.873 29。
在碰撞能量（CE）=30 eV，有关物质6的二级正离子质谱图见图 12。
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图 12 有关物质6在CE=30 eV能量下正离子二级质谱低质量范围图 Figure 12 The secondary positive(+)low mass range spectrum of the related compound 6 at CE=30 eV |
此时，典型的碎片离子峰有m/z 166.107 56，m/z 117.054 51和m/z 74.060 07等，经拟合分子式分别为C6H16O4N，C5H9O3和C3H8ON。用Mass Frontier分析碎片离子的匹配机理，可预测有关物质6的裂解规律（B）如图 13所示。
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图 13 预测有关物质6的裂解规律（B） Figure 13 Speculated fragmentation pattern(B)of the related compound 6 |
O-烷基化合物在裂解过程中，可能生成3种形式的碎片离子m/z859.924 4，分别以不同裂解方式生成碎片离子m/z 166.107 38或碎片离子m/z 148.096 82，前后也可进一步裂解生成后者，在图 10中可见这2个碎片离子共存，前者强度略大于后者。而对于N-烷基化合物，裂解后生成仲胺，进而也可以形成m/z 166碎片，但是，N-烷基化合物形成的m/z 166碎片更容易脱水形成m/z 148结构，因此，如图 8所示，在N-烷基化合物的碎片离子m/z 148.096 68强度较强，而m/z166碎片强度较弱，甚至观察不到m/z 166碎片峰。结合Massfrontier软件，N-烷基化合物裂解机理如图 14所示。
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图 14 N-烷基化合物裂解规律 Figure 14 Fragmentation pattern of N-alkyl compounds |
其根据以上裂解规律，结合精确分子量的测量，从而可以推测有关物质6是O-烷基化合物而不可能是N-烷基化合物。
3 小结从结构图上可知，碘海醇有6个羟基原则上，其中任一个都可能形成O-烷基化合物。它们在HPLC上的保留时间在不同的化合物间也许稍有不同。另外，这些化合物也可以和碘海醇一样产生内-外型异构体（exo-endo isomerism），因此，在HPLC上呈现一组峰。然而，基于动力学考虑，不可能形成任何二-O-烷基化合物，从反应活性而言，第一羟基远比第二羟基生成的O-烷基化合物多得多。
N-烷基化合物和O-烷基化合物都是结构异构体，它们有准确的相同分子量，在质谱上有相同的基峰，难以根据精确分子量峰推测它们的结构，或以此区分它们是O-烷基化合物还是N-烷基化合物。
采用Thermo Scientific QE Focus质谱仪对碘海醇中各有关物质进行分析，将高性能四极杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数（HR/AM）Orbitrap检测技术相结合，提供了良好的质量精度（质量偏差均1×10-6），运用二级质谱获得的碎片信息，结合结构解析软件MassFrontier帮助解析化合物结构，提高工作效率，可得到更可靠的结果。
根据碘海醇样品总离子流图中不同保留时间峰，分别对分离出的11种有关物质进行质谱分析，结合质谱中一级和二级特征离子碎片以及裂解规律：（1）O-烷基化合物更容易形成m/z 803.877 0碎片离子；（2）N-烷基化合物可形成m/z 112.075 69、m/z 104.070 60和m/z 86.060 04碎片离子；（3）O-烷基化化合物更易形成m/z 166.107 38碎片离子。可以推测出有关物质1~5为N-烷基化化合物，有关物质6~11为O-烷基化合物。
然而，由于目前有关碘海醇杂质研究的文献较少，仅根据上述质谱研究的信息尚不能确定N-烷基化化合物和O-烷基化合物的取代基位置和结构差异，有待采用更多的组合技术进一步研究。
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