2017, Vol. 37 
2. 河南省食品药品检验所, 郑州 450003;
3. 首都医科大学附属北京同仁医院急诊科, 北京 100730
2. Henan Provincial Institute of Food and Drug Control, Zhengzhou 450003, China;
3. Emergency Department, Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100730, China
软琼脂克隆形成实验采用肿瘤细胞系或转化细胞系，通过观察细胞在软琼脂中的细胞集落形成能力，对其可能发生转化并在动物体内的成瘤性潜能进行评价。FDA有关使用动物细胞生产的生物制品的相关法规中指出，体外软琼脂克隆形成实验可为细胞致瘤性评价提供更多的信息[1]。有研究比较软琼脂克隆形成实验与裸鼠体内接种法的检测结果，发现两者相关性较好，且前者更为灵敏[2]。对于肿瘤细胞系，细胞传代次数与软琼脂克隆法的敏感性成正相关。
本研究分别利用肿瘤细胞系(Hela，K562和HepG2) 和转化细胞系(Bhas 42) 建立了6孔板固态培养法体外软琼脂克隆形成实验方法，并利用该方法对冬凌草甲素(oridonin，ORI)的抑瘤性和没食子酸乙酯(ethyl gallate，EG)的促瘤性进行评价。此外本研究还通过细胞周期分析，药物的抑瘤性/促瘤性与细胞增殖的关系进行分析。其中Bhas 42细胞是在Balb/c 3T3细胞基础上导入小鼠纤维性肉瘤病毒v-Ha-vas基因构建而成，认为已处于启动状态[3]。该细胞系暴露于非遗传毒性致癌物条件下，无需经过启动剂的预处理便可引起细胞恶性转化。利用其开展软琼脂克隆形成实验并用来评价药物成瘤性，尚未见文献报道。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂与培养基ddH2O使用MilliQ-A10超纯水机生产的超纯水，121℃、15 min高压灭菌，4 ℃冰箱保存；豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate，PMA，Sigma公司)；冬凌草甲素对照品(oridonin，ORI，中国食品药品检定研究院)；没食子酸乙酯(ethyl gallate，EG，Sigma公司)；RPMI 1640培养基(Hyclone公司)；MEM培养基(Gibco公司)；DMEM/F12培养基(Gibco公司)；胎牛血清(FBS，Ausvin公司)；1%青链霉素混合液(南京凯基生物技术发展有限公司)；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(Gibco公司)；琼脂糖(Life公司)；PBS(Hyclone公司)；PI/RNase Staining Buffer(BD公司)。
1.1.2 细胞系及培养条件Hela、K562及HepG2(传代次数大于100次)来自中国医学科学院细胞库，采用RPMI1640(10% FBS)复苏，并于37 ℃、5%CO2条件下扩增培养。Bhas 42细胞系(BALB/c 3T3细胞系经v-Has-ras基因转染后构建，传代次数10次以内)来自日本JCRB细胞库，用MEM(含15% FBS)培养基复苏并接种于25 cm2培养瓶中，于37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞密度约为70%~80%时改用含5% FBS的DMEM/F12培养基传代扩增。
1.2 软琼脂克隆形成实验(6孔板固态培养法) 1.2.1 0.5%底层琼脂的制备采用超纯水制备1%琼脂糖溶液，将其于121 ℃，15 min条件下高压灭菌，置于42 ℃水浴，加入含20% FBS的2×细胞培养液等体积混合，使琼脂糖终浓度为0.5%，迅速倒入6孔细胞培养板中，每孔4 mL。室温凝固后置2~8 ℃保存备用。使用前需在37 ℃培养箱内平衡30 min以上。
1.2.2 0.35%上层琼脂的制备将制备好的0.7%琼脂糖溶液置于42 ℃水浴。用培养基将细胞制成单细胞悬液，计数，并稀释为2.5×104个·mL-1(以每孔5 000个细胞为例)。取无菌试管，每管加细胞液0.2 mL、含20% FBS的2×细胞培养液2 mL和0.7%琼脂糖2 mL，混合均匀后铺在底层琼脂上，每孔2 mL，共2个复孔。室温凝固后，置37 ℃孵箱培养14~21 d。
1.2.3 镜下观察细胞经连续培养约16 d后在显微镜下观察，计数大于10个细胞的集落数，并计算细胞克隆形成率(细胞克隆形成率=平均每孔细胞克隆数/每孔中加入的细胞数×100%)。
1.2.4 细胞接种密度的选择分别按每孔500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000个的密度接种Hela、K562、HepG2及Bhas 42细胞，其中Bhas 42细胞分无处理组和PMA(50 ng·mL-1)处理组，PMA采用0.1%DMSO现用现配，每组平行2孔。Bhas 42细胞为可转化细胞，PMA处理组和下述的EG给药组细胞铺板前使用的Bhas 42细胞均预先经PMA给药10 d，此时镜下可观察到转化灶的形成(图 1)。持续观察克隆形成情况，铺板、观察、计数方法同上。
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A.未转化(untransformed) B.转化(transformed) 图 1 Bhas 42细胞形态图 Figure 1 Representative images of Bhas 42 cells(10×10) |
根据预实验结果确定HepG2及Bhas 42细胞接种密度为每孔1 000个。HepG2细胞设空白对照组(ddH2O)、溶媒对照组(0.1%和1%DMSO)、ORI(0.016、0.08、0.4、2、10、50 μg·mL-1)组；Bhas 42细胞设空白对照组(ddH2O)、溶媒对照组(0.1% DMSO)、阳性对照组(PMA 50、100 ng·mL-1)、和EG(0.3、1、3 μg·mL-1)组。ORI、PMA、EG溶液均采用0.1%DMSO配制，现用现配。制备上层琼脂时将相应浓度的药物、浓度为0.5×104个·mL-1的细胞液0.2 mL、含20% FBS的2×细胞培养液2 mL和0.7%琼脂糖2 mL混合均匀后铺在底层琼脂上，每孔2 mL，每组平行2孔。持续观察克隆形成情况，铺板、观察、计数方法同上。数据采用χ2检验对组间百分率进行统计学分析；如果1个或多个浓度组出现浓度依赖性和/或可重复性的集落克隆率增加，则判定为存在抑瘤性或成瘤性；反之则为阴性。
1.3 细胞周期分析HepG2和Bhas 42分别复苏于25 cm2培养瓶中，接种于6孔板。HepG2细胞设空白对照组(ddH2O)、溶媒对照组(0.1% DMSO)和ORI(0.016、0.08、0.4、2、10 μg·mL-1)组；Bhas42细胞设溶媒对照组(0.1% DMSO)和EG(0.3、1、3 μg·mL-1)组，连续给药处理5 d。给药培养结束后，经0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，转入离心管内，1 000 r·min-1离心5 min。再使用3 mL PBS洗涤2次，1 000 r·min-1离心5 min，细胞以移液器吹打均匀。将上述PBS细胞悬液加入5 mL 4 ℃预冷的70%乙醇中，封口，4 ℃过夜。1 200 r·min-1离心5 min收集细胞，使用PBS洗涤2次。每管加入PI/RNase Staining Buffer 0.5 mL，染色15 min，移液器吹打均匀，过300目尼龙筛。轻弹试管后，使用流式细胞仪(BD FACS CaliburTM Flow Cytometer)进行检测。分析用软件为Modfit LT(Verity Software House)。各组数据采用单因素方差分析，当P < 0.05时差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 软琼脂克隆形成实验条件结果显示(表 1)不同肿瘤细胞系的克隆形成率在细胞接种密度为每孔500~2 000个时较高，当细胞接种密度超过每孔5 000个时，克隆形成率呈下降趋势。实验中观察到大克隆的周围往往会形成多个小克隆，接种密度大于每孔5 000个容易出现克隆融合，影响计数结果；而接种密度为每孔500个时多形成小克隆，亦不便于观察区分。克隆形成率与细胞密度有关，细胞接种太密集(每孔大于5 000个)时，可因缺乏营养而影响细胞生长。铺板2周左右可观察到因细胞接种密度不同引起的培养基颜色深浅差异。因此采用Hela、HepG2或K562考察药物对克隆形成是否存在抑制作用时，6孔细胞培养板的接种密度选用每孔1 000个较为适宜。以上结论也符合文献报道[2, 4]。考虑到3周后克隆密度较大，可在铺板后14~16 d左右进行观察(图 2)。因肿瘤细胞的代数与成瘤性密切相关，研究前应大量扩增相同代数细胞用于试验。
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表 1 肿瘤细胞系细胞接种密度与克隆形成率比较(n=2) Table 1 Comparison of cell seeding densities and clone formation rates in tumor cell lines |
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图 2 软琼脂克隆形成实验细胞成瘤图例 Figure 2 Representative image of soft agar colony formation assay |
Bhas 42细胞是在Balb/c 3T3细胞基础上导入了小鼠纤维性肉瘤病毒v-Ha-vas基因构建的一种为转化细胞系[5-6]。PMA作为促癌剂用作Bhas 42细胞转化实验的阳性对照[6]。文献报道PMA可通过激活蛋白激酶C发挥致癌活性[7]。未经促癌剂PMA处理的细胞的克隆形成率在各个密度下条件下均低于PMA(50 ng·mL-1)处理组。提示以Bhas 42细胞系研究药物是否有促瘤作用，并以PMA作为阳性对照是适宜的。在细胞接种密度为每孔1 000~2 000个时，阴性组与阳性组的克隆数差异最为明显。
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表 2 转化细胞系(Bhas 42) 细胞接种密度与克隆形成率比较(n=2) Table 2 Comparison of cell seeding densities and clone formation rates in transformed bhas 42 cell line |
如表 3所示，与空白对照比较，以0.1%DMSO为溶媒HepG2细胞的克隆形成率与对照组无显著差异，1%DMSO可增加克隆形成率但与对照组比较未见统计学意义上的显著差异(P＞0.05)。ORI作为抑瘤药物在低浓度条件下即显示了显著抑瘤性(P＜0.01) 且呈现给药浓度相关趋势。
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表 3 冬凌草甲素对HepG2细胞克隆形成的作用(n=2) Table 3 Effects of oridonin to the clony formation of HepG2 cells |
为验证克隆数形成的减少是否与细胞增殖能力有关，进一步对ORI是否对HepG2细胞的细胞周期进行分析。结果发现随着ORI处理浓度的升高，停留在G1期的细胞比率逐渐增加，S期细胞比率相应减少(P＜0.01)，即存在一定的G1期阻滞，提示ORI通过抑制遗传物质复制抑制细胞增殖。
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表 4 冬凌草甲素对HepG2细胞周期的影响(n=3) Table 4 Effects of oridonin to the cell cycle of HepG2 cells |
与空白对照组克隆形成率(4.6%)及溶媒对照组克隆形成率(5.9%)比较，PMA阳性对照组高浓度条件下的克隆形成率(16.1%)具有显著性增加(P < 0.01)。EG高浓度组(3 μg·mL-1，克隆形成率为16.0%)与溶媒对照组比较存在显著性增加(P < 0.01)，且克隆形成率的增加呈浓度相关趋势。提示EG促进了Bhas 42细胞恶性转化，细胞成瘤性增加。在进一步的细胞周期分析结果(表 6)中观察EG对Bhas 42细胞的G1期和S期细胞百分率并未产生显著改变(P > 0.05)。提示药物并非通过影响细胞周期来增强细胞成瘤性。
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表 5 没食子酸乙酯对Bhas42细胞克隆形成的作用(n=2) Table 5 Effects of ethyl gallate to the clony formation of Bhas42 cells |
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表 6 没食子酸乙酯对Bhas42细胞周期的影响(n=3) Table 6 Effects of ethyl gallate to the cell cycle of Bhas42 cells |
本研究结果提示ORI对肝癌细胞成瘤率有明显抑制，文献报道ORI具有抗肝癌效应[8-10]。ORI的抗肿瘤分子机制可能与端粒酶活性改变而诱导细胞凋亡有关，而端粒酶的活性受到细胞周期的影响[11-13]。ORI的具体作用机制可能与诱发肿瘤细胞凋亡，影响细胞周期等有关。
EG是一种酚类抗氧化剂食品添加剂。赵景春等人[14]采用BALB/c 3T3细胞模型研究证明没食子酰没食子儿茶素(EGCG)对PMA的促癌作用有抑制作用。文献报道没食子酸丙酯(propyl gallate，PG)可能具有致癌性。而EG与PG结构相似，课题组前期通过Bhas 42细胞转化试验高通量检测方法发现与空白对照组相比，EG可以促进Bhas 42细胞发生转化并具有显著性差异，推测EG可能具有非遗传毒性致癌性[15]。将转化后的Bhas 42细胞进行体外软琼脂克隆形成实验，验证EG对Bhas 42成瘤性的影响，结果表明EG转化后的Bhas 42细胞成瘤性显著增加，细胞发生恶性转化，佐证了EG可能具有非遗传毒性致癌性风险。
软琼脂克隆形成实验采用肿瘤细胞系或转化细胞系，通过观察细胞在软琼脂中的细胞集落形成能力，对其可能发生转化并在动物体内的成瘤性潜能进行早期预测和筛选，之后再针对获得阳性结果的供试品有针对性地开展动物实验。本实验采用HepG2细胞和Bhas 42细胞分别对药物抑瘤性以及成瘤性进行评价，该方法简单、经济，并且不需要特殊仪器设备，结果可靠，可以很好支撑体内致瘤性试验结果。其中肿瘤细胞系和转化细胞系的状态是该方法成功的关键。肿瘤细胞系的克隆形成能力随细胞代数增多而提高，建议使用传代次数在100代以上的细胞系，且评价不同药物时使用的细胞代数差异不大。而转化细胞系的转化能力则随着细胞传代次数增加而逐渐降低，因此应将使用时的细胞代数控制在10代以内。转化细胞首先需要经药物处理，明确观察到转化灶的发生以确定细胞转化能力优良之后，才能继续用于软琼脂克隆形成实验。其次，克隆形成的大小与培养基、培养条件及时间等因素有关，克隆的计数标准也需进行一定规范化。各个实验室课通过积累相关的背景数据，有助于对药物的作用做出合理评价。在对药物的成瘤性和抑瘤性进行判断时，应与其他体外或体内研究结果结合综合考虑。
肿瘤的发生发展与细胞周期机制调控息息相关。细胞癌变后细胞周期抑制基因活性受到抑制，从而导致细胞周期进程快速运转，例如p53/p21和p16INK4a/pRB基因[16-18]等。而传统的致癌实验耗费大量动物，且实验周期在2~3年，费时费力。本研究首次利用Bhas 42转化细胞对药物的成瘤性进行评价，该结果可与Bhas 42细胞转化试验有机结合，对评价药物或新型化合物潜在致癌性具有重要的实际意义。将软琼脂克隆形成实验与细胞周期分析或其他肿瘤相关因子表达研究相结合，有助于更好地对药物的潜在抑癌性或致癌性进行早期筛选和预测。
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