2017, Vol. 37 
2. 辽宁华润本溪三药有限公司, 本溪 117004
2. China Resources Liaoning Benxi Third Pharmaceutical Co., Ltd., Benxi 117004, China
北方透骨草为豆科(Leguminosae)野豌豆属(Vicia L.)山野豌豆(Vicia amoena Fisch.)和狭山野豌豆(Vicia amoena Fisch.var.angusta Freyn.)的干燥地上部分，现收载于2015年版中国药典四部附录[1]、《辽宁植物志》[2]、《中药大辞典》[3]等，具有祛风除湿，活血止痛之功效，用于治疗风湿疼痛、痤疮肿毒[4]等症。2015年版中国药典一部成方制剂中，有3个制剂的处方中含有透骨草，分别为坎离砂[5]911、养血荣筋丸[5]1279、疏痛安涂膜剂[5]1640。课题组对山野豌豆的变种狭山野豌豆进行化学分离，得到黄酮类化合物山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚。其中山柰酚[6]具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒作用；槲皮素[7]可以抗癌、抗炎、抗氧化、抗突变；苜蓿素[8]也具有抗癌、抗氧化、抗病毒等作用。本实验采用HPLC法[9-14]检测山野豌豆与狭山野豌豆中山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚的含量，以期为山野豌豆与狭山野豌豆质量标准的建立提供可靠依据。
1 仪器与材料CTO-20AC高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；北京迪马科技有限公司)；BS124S精密电子分析天平(赛多利斯仪器有限公司)；Direct-Q3超纯水器(法国MILLIPORE)；KQ5200B超声提取器(昆山市超声仪器有限公司)。
对照品山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚均为本实验室采用硅胶柱层析法提取分离药材狭山野豌豆制得，质量分数均≥98%。乙腈、磷酸、甲醇为色谱纯，，实验用水为二次纯化水。山野豌豆茎叶(SY150701、SY150705、SY150712、SY150912、SY150918、SY150922) 与狭山野豌豆茎叶(批号为XY150701、XY150705、XY150712、XY150912、XY150918、XY150922) 均为本实验室采自辽宁省，经辽宁省药品检验检测院中药室王维宁主任药师鉴定为豆科植物(Leguminosae)野豌豆属(Vicia L.)植物狭山野豌豆(Vicia amoena Fisch.var.angusta Freyn)和山野豌豆(Vicia amoena Fisch.)；药材留样存放于辽宁省药品检验检测院中药室标本室。
2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱，见表 1；流速：1.0 mL·min-1；紫外检测波长：350 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，对照品与样品中被测组分均能达到基线分离，峰形对称，分离度好，结果见图 1。
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表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program |
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1.山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside) 2.槲皮素(quercetin) 3.苜蓿素(tricin) 4.山柰酚(kaempferol) 图 1 混合对照品(A)、山野豌豆(B)狭山野豌豆(C)HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), Vicia amoena Fisch(B)and Vicia amoena Fisch.var.angusta Freyn.(C) |
分别取山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚的对照品适量，精密称定，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚质量浓度分别为1 369.60、1 267.20、665.60、689.60 μg·mL-1的混合溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备 2.3.1 山野豌豆供试品溶液精密称取山野豌豆茎叶粉末(4号筛)5 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇水溶液50 mL，超声(频率为40 kHz，功率为200 W)提取2次，每次30 min，滤过，合并滤液，滤液蒸至近干；残渣加水50 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次50 mL，合并乙酸乙酯液，挥干，残渣加甲醇使溶解，转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.3.2 狭山野豌豆供试品溶液精密称取狭山野豌豆茎叶粉末(4号筛)5 g，其余操作同“2.3.1”项方法，即得。
2.4 线性关系考察及检测限测定精密量取混合对照品溶液10.00、5.00、2.50、1.50、0.30、0.10 mL，分别置20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到包括原浓度在内的7个浓度的混合对照品溶液，各质量浓度溶液分别过0.22 μm微孔滤膜，进样10 μL，进行色谱分析；以峰面积值(A)对质量浓度(C)进行线性回归，分别得山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素和山柰酚回归方程：
A=2.000 0×107C-38 075 r=0.999 9
A=3.000 0×107C+63 834 r=0.999 8
A=1.000 0×107C-19 695 r=0.999 9
A=3.000 0×107C-78 995 r=0.999 9
质量浓度分别在6.85~1 369.60、6.34~1 267.20、3.33~665.60、3.45~689.6 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。
按照信噪比3︰1，山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚检测限分别为0.20、0.21、0.21、0.20 μg·mL-1。
2.5 精密度试验取山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚质量浓度分别为171.20、158.40、166.40、172.40 μg·mL-1的混合对照品溶液，连续进样6次，结果上述各化合物峰面积的RSD(n=6) 分别为0.37%、0.37%、0.31%、0.44%。
2.6 稳定性试验取同一批山野豌豆茎叶(批号SY150912) 按“2.3.1”项方法处理后，分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μL；结果山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚峰面积的RSD(n=6) 分别为0.76%、0.29%、1.1%、2.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
取同一批狭山野豌豆茎叶(批号XY150918) 按“2.3.2”项方法处理后，分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μL；结果山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚峰面积的RSD(n=6) 分别为0.24%、1.7%、2.2%、0.49%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验取同一批山野豌豆茎叶(批号SY150912) 按“2.3.1”项方法平行制备6份供试品溶液，进样10 μL；结果山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚平均含量(n=6) 分别为0.139、0.111、0.081、0.153 mg·g-1，RSD分别为1.1%、0.64%、1.5%、2.3%。
取同一批狭山野豌豆茎叶(批号XY150918) 按“2.3.2”项方法平行制备6份供试品溶液，进样10 μL；结果山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚平均含量(n=6) 分别为0.100、0.100、0.105、0.102 mg·g-1，RSD分别为2.2%、1.6%、2.1%、1.3%。
2.8 加样回收率试验取同一批已测知含量的山野豌豆茎叶(批号SY150912)，精密称取2.5 g，平行6份，置具塞锥形瓶中，分别加入混合对照品溶液(山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷质量浓度为342.40 mg·L-1，槲皮素质量浓度为316.80 mg·L-1，苜蓿素质量浓度为166.40mg·L-1，山柰酚质量浓度为344.80 mg·L-1)1.0 mL，按照“2.3.1”项方法处理后按“2.1”项色谱条件进样分析；结果山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚的平均回收率(n=6) 分别为99.1%、98.2%、100.1%、98.3%，RSD分别为1.3%、1.0%、1.7%、0.90%。
取同一批已测知含量的狭山野豌豆茎叶(批号XY150918)，精密称取2.5 g，平行6份，置具塞锥形瓶中，分别加入混合对照品溶液(山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷质量浓度为171.20 mg·L-1，槲皮素质量浓度为158.40 mg·L-1，苜蓿素质量浓度为166.40mg·L-1，山柰酚质量浓度为172.40 mg·L-1)1.5 mL，按照“2.3.2”项方法处理后按“2.1”项色谱条件进样分析。结果山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚的平均回收率(n=6) 分别为98.9%、98.1%、99.6%、98.1%，RSD分别为1.0%、0.86%、1.2%、0.99%。
2.9 样品测定取6批山野豌豆茎叶样品各2份，按照“2.3.1”项方法制备供试品溶液，每份溶液按“2.1”项色谱条件进样测定2次，结果见表 2。
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表 2 山野豌豆样品测定结果(mg·g-1) Table 2 The determination results of Vicia amoena Fisch. |
取6批狭山野豌豆茎叶样品各2份，按照“2.3.2”项方法制备供试品溶液，每份溶液按“2.1”项色谱条件进样测定2次，结果见表 3。
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表 3 狭山野豌豆样品测定结果(mg·g-1) Table 3 The determination results of Vicia amoena Fisch.var. angusta Freyn. |
透骨草具有祛风除湿及活血止痛功能，用于风湿疼痛、痤疮肿毒等，始见于明· 《救荒本草》[15]，《中国植物志》[16]、《辽宁植物志》均有记载，为中国药典2015年版四部附录收载品种。《辽宁省中药材标准第一册》(2009年版)[17]收载有山野豌豆、假香野豌豆、广布野豌豆3个物种，但毛山野豌豆、狭山野豌豆在《中国植物志》、《辽宁植物志》中记载为山野豌豆的变种，在辽、吉、黑三省广为习用，且中国药典2015年版四部附录也把毛山野豌豆、狭山野豌豆单列在透骨草中。
通过对山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚进行紫外扫描得知：以上4个单体成分在212、260、350 nm处有最大吸收。但是，212 nm处于末端吸收，样品中有其他杂质进行紫外吸收，从而产生干扰峰，影响目标峰的分离度。并且经过比较发现在350 nm处4个单体成分均有最大紫外吸收值。因此，将350 nm作为4个单体成分的检测波长。
由于4个单体成分均为黄酮类化合物，并且化合物结构较为类似，因此分别尝试使用甲醇与冰醋酸、甲醇与磷酸、乙腈与冰醋酸、乙腈与磷酸作为流动相，调节柱温以及使用不同的色谱柱(Diamonsil C18、Agilent ZORBAX SB-Phenyl)等色谱条件进行山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚的色谱分析。结果发现：流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液；紫外检测波长为350 nm；柱温25 ℃时，4个单体化合物分离度较高，基线平稳，峰型对称，达到检测分离的目的。
药材提取方法采用超声提取，本试验对超声时间进行了考察，依次为10、20、30、40、50 min，发现30 min以后，所提取样品中4个黄酮的量基本一致。鉴于节省试验时间与能源，将超声提取时间定为30 min。所用提取溶剂选择，通过40%~95%乙醇水溶液提取通过液相色谱检测，发现70%乙醇水溶液提取物中黄酮量最多，但是色谱图中对照品峰附近有杂质峰干扰，因此，采用乙酸乙酯萃取，去除杂质峰。从实验结果看山野豌豆与狭山野豌豆各6批样品的含量差别较大，可能是由于样品采集时间不同，生长地点以及生长环境不同(光照、水分、土壤等)造成的。
通过对透骨草山野豌豆与狭山野豌豆的研究文献以及处方应用[18-22]查找发现：其处方在民间的使用较为广泛，但是对其质量控制标准报道较少。本实验室对山野豌豆与狭山野豌豆中的主要成分进行定量分析，建立的HPLC方法简单快速，灵敏度高，准确可靠，为其载入《药典》以及部颁标准奠定了基础。同时也为临床检测富含山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚的药材和制剂提供了良好的检测手段。
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