2017, Vol. 37 
2. 吉林农业大学, 长春 130117
2. Jilin Agricultural University, Changchun 130117, China
荆防败毒丸具有清热散风、解毒消肿的功效，主要用于流行性感冒、恶寒发热、头痛咳嗽、瘟毒发颐等的治疗，该中药复方制剂由土茯苓、川芎、荆芥、防风、党参、甘草、桔梗、薄荷、前胡、柴胡、枳壳、独活、羌活共13味中药材加工而成，收载于卫生部部颁药品标准(中药成方制剂第一册)[1]。现标准仅规定了荆防败毒丸的性状、显微鉴别及制剂通则的检查项[1-2]，未对该制剂处方中的任何药物所含成分进行定量测定，也未检索到对该制剂所含成分进行定量检测的文献报道。本品处方工艺中的土茯苓解毒、除湿、利关节；川芎活血行气、祛风止痛，是治疗头痛的首选药物。为确保该产品的质量稳定和疗效的一致性，本文以土茯苓中所含5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇与川芎中所含洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯为指标成分，采用波长切换HPLC梯度洗脱法同时测定5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯的含量，为荆防败毒丸的质量标准的提高提供有效依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器HP1100高效液相色谱仪(Agilent公司)，配备Agilent 1100色谱工作站，G1315B可变波长检测器；Shiseido C18(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；株式会社资生堂公司)色谱柱；梅特勒托利多AE240电子天平(Mettler Toledo公司)；KQ-100DB数控超声仪(江苏省昆山超声仪器有限公司)。
1.2 试药对照品5-O-咖啡酰莽草酸(批号73263-62-4，纯度98.0%)购于Honest Joy Holdings Limited公司；对照品落新妇苷(批号111798-201504，纯度100.0%，4℃、避光保存)、花旗松素(批号111816-201102，纯度98.9%，阴凉处、避光保存)、黄杞苷(批号111906-201102，纯度93.7%，室温干燥保存)、白藜芦醇(批号111535-200502，纯度98.0%，干燥密闭保存)、藁本内酯(批号111737-201507，纯度98.0%，-20℃、避光保存)购于中国食品药品检定研究院；对照品洋川芎内酯H(批号94596-27-7，纯度97.0%)、洋川芎内酯Ⅰ(批号94596-28-8，纯度97.0%)、洋川芎内酯A(批号62006-39-7，纯度97.0%)、瑟丹酸内酯(批号6415-59-4，纯度97.0%)购于上海纯优生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为重蒸馏水。
荆防败毒丸(水丸，每10粒重1 g，批号为150912、151125、151207) 购于四川禾润制药有限公司。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 供试品溶液取荆防败毒丸适量，研成细粉，称取8.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入80%乙醇水溶液50 mL，具塞，称量，记录数据，超声(100 W，40 kHz)处理30 min，放冷，再次称量，用80%乙醇水溶液补足减失的量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
2.1.2 混合对照品溶液分别精密称取5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯的对照品各适量，用80%乙醇水溶液溶解并稀释，分别制成单一成分的对照品储备液(5-O-咖啡酰莽草酸1.826 mg·mL-1，落新妇苷4.150 mg·mL-1，花旗松素0.708 mg·mL-1，黄杞苷0.956 mg·mL-1，白藜芦醇0.484 mg·mL-1，洋川芎内酯H0.676 mg·mL-1，洋川芎内酯Ⅰ0.988 mg·mL-1，洋川芎内酯A1.272 mg·mL-1，瑟丹酸内酯0.614 mg·mL-1，藁本内酯1.932 mg·mL-1)；再分别吸取各单一成分的对照品储备液：5-O-咖啡酰莽草酸5.0 mL、落新妇苷6.0 mL、花旗松素2.5 mL、黄杞苷5.0 mL、白藜芦醇2.5 mL、洋川芎内酯H 2.5 mL、洋川芎内酯Ⅰ 2.5 mL、洋川芎内酯A 5.0 mL、瑟丹酸内酯5.0 mL和藁本内酯5.0 mL，置同一100 mL量瓶中，加80%乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
2.1.3 阴性样品溶液按荆防败毒丸生产工艺过程分别制备缺少土茯苓、川芎的阴性样品，按照“2.1.1”项下方法制备土茯苓阴性样品溶液和川芎阴性样品溶液。
2.2 色谱条件采用Shiseido C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相：A相甲醇-乙腈(3:1)，B相为0.1%醋酸水溶液，梯度洗脱[3-7](0~15 min，32.0%A；15~26 min，32.0%A→43.0%A；26~37 min，43.0%A→62.0%A；37~69 min，62.0%A→85.0%A；69~75 min，85.0%A→32.0%A)；流速：1.2 mL·min-1；0~37 min时在291 nm[8-9]波长下检测5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷和白藜芦醇，37~75 min在280 nm[10-12]波长下检测洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯。理论塔板数按所测各成分色谱峰计均不低于2 500，分离度均不小于1.5。此系统条件下所测成分之间及与其他成分分离效果良好，且峰形较好。
2.3 含量测定方法学考察 2.3.1 线性关系考察分别精密吸取“2.1.2”项下的10个对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，将其分别置于20 mL量瓶中并用80%乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得到一系列浓度的混合对照品溶液，按照上述测定方法进行测定，采用质量浓度X作为横坐标，测得的峰面积Y作为纵坐标，绘制标准曲线，5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯回归方程、线性范围详见表 1。
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表 1 0个成分的回归方程及线性关系 Table 1 Regression equations and linear range of ten components |
分别精密吸取“2.1.3”项下的土茯苓阴性样品溶液、川芎阴性样品溶液及“2.1.2”项下的混合对照品溶液和“2.1.1”项下的供试品溶液，在上述色谱条件下依法进行测定。专属性试验结果表明，土茯苓阴性样品、川芎阴性样品的色谱图中，在10个成分对应的位置无干扰，表明该方法专属性良好，色谱图详见图 1。
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1. 5-O-咖啡酰莽草酸(5-O-caffeoylshikimic acid) 2.落新妇苷(astilbin) 3.花旗松素(taxifolin) 4.黄杞苷(engeletin) 5.白藜芦醇(resveratrol) 6.洋川芎内酯H(senkyunolide H) 7.洋川芎内酯Ⅰ(senkyunolide Ⅰ) 8.洋川芎内酯A(senkyunolide A) 9.瑟丹酸内酯(sedanolide) 10.藁本内酯(ligustilide) 图 1 样品(A)、对照品(B)、土茯苓阴性样品(C)、川芎阴性样品(D)色谱图 Figure 1 Chromatograms of sample(A), reference substances(B), negative sample without Smilacis Glabrae Rhizoma(C)and negative sample without Chuanxiong Rhizoma(D) |
取“2.1.1”项下的同一样品(批号150912) 的供试品溶液，分别于配制后在室温下放置0、2、4、8、12 h，按“2.2”项色谱条件进样测定待测成分峰面积，求得测定5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯峰面积的RSD依次为1.2%、0.78%、1.5%、1.0%、0.49%、0.76%、1.2%、0.85%、1.1%和0.97%，表明供试品溶液制备后12 h内较稳定。
2.3.4 重复性试验取同一批样品(批号150912)6份，分别按“2.1.1”项方法制备6份供试品溶液，按“2.2”项的色谱条件进行测定，计算荆防败毒丸中的5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯平均含量分别为0.578、1.661、0.105、0.332、0.071、0.103、0.161、0.437、0.180、0.587 mg·g-1，RSD分别为1.4%、0.96%、1.3%、0.85%、0.64%、0.69%、1.2%、0.87%、1.3%和0.62%。结果表明本方法重复性良好。
2.3.5 仪器精密度试验取“2.1.2”项下的混合对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件连续进样6次，记录待测成分的峰面积并计算RSD，结果5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯峰面积的RSD依次为0.95%、0.88%、1.0%、0.57%、0.81%、1.3%、0.97%、1.1%、0.95%和0.43%，显示仪器精密度良好。
2.3.6 加样回收率试验取已知含量荆防败毒丸样品(批号150912) 适量，分成6份，每份4.0 g，分别精密称定，加80%乙醇水溶液及“2.1.2”项下混合对照品溶液各25 mL，按“2.1.1”项下方法制备供试溶液，按“2.2”项下的色谱条件依法测定，计算10个成分的回收率和相对应的RSD，结果见表 2。
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表 2 回收率实验结果 Table 2 Results of recovery test |
取3个批号的荆防败毒丸，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进样测定，以外标法计算荆防败毒丸中10个待测物含量，结果见表 3。
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表 3 10个成分的含量测定结果(n=3，mg·g-1) Table 3 The contents of ten components |
为能兼顾荆防败毒丸中10个成分对提取溶剂要求，选取60%乙醇、80%乙醇水溶液和乙醇为提取溶剂进行考察；同时考察了超声提取时间(20、30、40 min)和水浴回流时间(20、30、40 min)对荆防败毒丸中10个成分提取率的影响，从而优化最佳的样品处理方法。综合考虑所测各成分的提取效果和操作的便捷性，最终选取80%乙醇水溶液超声提取30 min作为荆防败毒丸中10个成分同时测定的样品处理方法。
3.2 检测波长的选择本文所测土茯苓中的5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇和川芎中的洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯的最大紫外吸收波长不同，为准确反映各成分含量，通过波长切换法，选取所测成分的最大吸收波长进行测定。结果表明，在291 nm波长处5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇吸收值较大，在280 nm处洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯的峰吸收值较大，故采用波长切换法，选取291 nm(0~37 min)和280 nm(37~75 min)对荆防败毒丸中10个成分进行同时测定。
3.3 流动相的选择笔者在试验过程中分别采取乙腈-0.1%醋酸水溶液[3，13]、甲醇-0.2%的乙酸水溶液[4，14]、乙腈-0.025%磷酸水溶液[9]、乙腈-1%甲酸水溶液[11，15]、甲醇-乙腈(3:1) 与0.1%醋酸水溶液不同比例梯度洗脱，以10个待测成分色谱峰的出峰时间、峰形和分离度效果为评价指标进行综合评价，优选出荆防败毒丸中10个待测成分同时测定的最佳检测所使用的流动相。结果表明，以甲醇-乙腈(3:1) 与0.1%醋酸水溶液不同比例梯度洗脱时，10个待测成分色谱峰的出峰时间、峰形和分离度效果最佳，故选取甲醇-乙腈(3:1) 与0.1%醋酸水溶液作为流动相，按照本文确定的比例梯度洗脱。
4 结论本研究通过HPLC波长切换联合梯度洗脱技术，建立了同时测定荆防败毒丸中5-O-咖啡酰莽草酸、落新妇苷、花旗松素、黄杞苷、白藜芦醇、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯10个成分含量的方法。该方法简便、准确，可为中药成方制剂荆防败毒丸的质量控制方法的提高提供参考。
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