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  药物分析杂志   2017, Vol. 37 Issue (3): 407-413.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.03.06
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程夏倩, 周建良, 高向波, 张文婷, 赵维良. HPLC-ELSD法测定破壁灵芝孢子粉中8个油脂类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(3): 407-413. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.03.06.
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CHENG Xia-qian, ZHOU Jian-liang, GAO Xiang-bo, ZHANG Wen-ting, ZHAO Wei-liang. Determination of eight lipin components in Ganoderma lucidum spore powder by HPLC-ELSD[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2017, 37(3): 407-413. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.03.06.
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第一作者

程夏倩, Tel:(0571)86670402;E-mail:304960125@qq.com。

通信作者

张文婷, Tel:(0571)87180337;E-mail:leozhwt@163.com
赵维良, Tel:(0571)86452373;E-mail:zwl@zjyj.org.cn

文章历史

收稿日期：2016-03-25
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
HPLC-ELSD法测定破壁灵芝孢子粉中8个油脂类成分的含量
程夏倩 1, 周建良 2, 高向波 1, 张文婷 2, 赵维良 2    
1. 浙江大学医学院附属儿童医院, 杭州 310052;
2. 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 310052
收稿日期：2016-03-25
第一作者：程夏倩, Tel:(0571)86670402;E-mail:304960125@qq.com
通信作者：张文婷, Tel:(0571)87180337;E-mail:leozhwt@163.com
赵维良, Tel:(0571)86452373;E-mail:zwl@zjyj.org.cn
摘要：目的：采用HPLC-ELSD建立灵芝孢子粉中8种油脂类成分的含量测定方法。方法：采用ACCHROM Unitary-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-异丙醇（51：49），流速1.0mL·min-1，柱温30 ℃，检测器为蒸发光散射检测器（漂移管温度105 ℃，载气流速2.0 L·min-1）。结果：亚甘油三油酸酯、1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯、1，2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯、1，2-二油酸-3-亚油酸甘油酯、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯、甘油三油酸酯、1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯的线性范围分别为0.029~0.861 μg（r2=0.999 3）、0.147~4.404 μg（r2=0.998 8）、0.051~1.523 μg（r2=0.999 4）、0.280~8.388 μg（r2=0.999 3）、0.242~7.263 μg（r2=0.998 9）、0.613~18.40μg（r2=0.998 9）、0.342~10.25 μg（r2=0.999 0）、0.069~2.075 μg（r2=0.999 5）；加样回收率分别为100.3%、92.9%、102.2%、93.9%、94.2%、104.1%、99.6%和100.7%，RSD分别为4.6%、2.5%、3.0%、3.3%、3.1%、1.8%、2.9%和4.3%。测定了4批未破壁灵芝孢子粉和21批破壁灵芝孢子粉中油脂类成分的含量，结果4批未破壁灵芝孢子粉均检出上述8个油脂类成分；21批破壁灵芝孢子粉中上述8个油脂类成分含量分别为1.9~6.9、6.2~18.2、1.9~5.8、18.5~46.1、8.3~30.2、30.9~79.0、34.2~123.3和5.6~17.4 mg·g-1。结论：该方法适用于灵芝孢子粉的质量控制与评价。
关键词：灵芝孢子粉    油脂    高效液相色谱-蒸发光散射检测法    含量测定    质量控制    
Determination of eight lipin components in Ganoderma lucidum spore powder by HPLC-ELSD
CHENG Xia-qian1, ZHOU Jian-liang2, GAO Xiang-bo1, ZHANG Wen-ting2, ZHAO Wei-liang2    
1. The Children's Hospital, Zhejing University School of Medicine, Hangzhou 310052, China;
2. Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310052, China
Abstract: Objective: To establish a high performance liquid chromatography method with evaporative light scattering detector(HPLC-ELSD)for determination of eight lipin components in Ganoderma lucidum spore powder.Methods: The chromatographic separation was performed on an ACCHROM Unitary-C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm)with the mobile phase of acetonitrile-isopropanol(51:49). The flow rate was 1.0 mL·min-1 at 30℃ with the detection by ELSD(drift tube temperature was 105℃ and gas flow rate was 2.0 L·min-1).Results: The calibration curve was linear for trilinolein, 1, 2-linolein-3-olein, 1, 2-linolein-3-palmitin, 1, 2-olein-3-linolein, 1-palmitin-2-olein-3-linolein, triolein, 1, 2-olein-3-palmitin and 1, 2-olein-3-stearin in the ranges of 0.029-0.861 μg(r2=0.999 3), 0.147-4.404 μg(r2=0.998 8), 0.051-1.523 μg(r2=0.999 4), 0.280-8.388 μg(r2=0.999 3), 0.242-7.263 μg(r2=0.998 9), 0.613-18.40 μg(r2=0.998 9), 0.342-10.25 μg(r2=0.999 0), and 0.069-2.075 μg(r2=0.999 5), respectively. The contents of above eight lipin components were determined in 4 batches of sporoderm-unbroken Ganoderma lucidum spore powder samples and 21 batches of sporoderm-broken Ganoderma lucidum spore powder samples. All the eight components were not detected in 4 batches of sporoderm-unbroken Ganoderma lucidum spore powder. The contents of eight lipin components in 21 batches of sporoderm-broken Ganoderma lucidum spore powder were 1.9-6.9 mg·g-1, 6.2-18.2 mg·g-1, 1.9-5.8 mg·g-1, 18.5-46.1 mg·g-1, 8.3-30.2 mg·g-1, 30.9-79.0 mg·g-1, 34.2-123.3 mg·g-1, and 5.6-17.4 mg·g-1.Conclusion: The method can be used for quality control of Ganoderma lucidum spore powder.
Key words: Ganoderma lucidum spore powder    lipin    HPLC-ELSD    quantitative determination    quality control    

灵芝为多孔菌科灵芝属真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss. ex Fr.)Karst.和紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子实体[1]。灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的淡雾状的极其微小的孢子，具有调节免疫、抗肿瘤、调节血脂、降低血糖、调节神经系统及心血管系统等多种药理作用[2-10]。近年来，从灵芝孢子粉中经超临界二氧化碳流体萃取的灵芝孢子油，由于其显著的抗肿瘤及免疫增强等功效而备受关注[11]。一般认为灵芝孢子油的临床作用与其含有丰富的不饱和脂肪酸特别是油酸、亚油酸有密切的关系[12]。油脂类成分具有抗肿瘤活性且含量高，可作为灵芝孢子粉质量控制的指标性成分[13-14]。周晓宏等[14]采用高效液相色谱蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法测定了灵芝孢子油中三油酸甘油酯的含量，秦臻等[15]采用气相色谱法建立了破壁灵芝孢子粉中油酸和亚油酸的含量测定方法。但目前对灵芝孢子粉或灵芝孢子油中的油脂类成分进行全面系统的含量测定罕有报道。为此，本文在分析灵芝孢子粉油脂类成分的基础上，采用HPLC-ELSD法对灵芝孢子粉中的8个油脂类成分进行含量测定研究，为灵芝孢子粉全面的质量控制提供技术支持和参考依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200系列高效液相色谱仪(配备G1322A在线脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样仪、G1316A柱温箱、Chemstation色谱工作站；安捷伦公司)；ACCHROM Unitary-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；华谱科仪(北京)科技有限公司)；AG285电子天平(METTLER TOLEDO)；Alltech 2000ES蒸发光散射检测器(奥泰科技(中国)有限公司)；数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)。

乙腈、异丙醇为色谱纯，试验用水为Milli-Q系统制备(电阻率18.2 MΩ.cm@25 ℃)。

对照品亚甘油三油酸酯(trilinolein(9c，12C)；货号：33-1820)、1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯(1，2-linolein-3-olein(rac)；货号：34-1866)、1，2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯(1，2-linolein-3-palmitin(rac)；货号：34-1862)、1，2-二油酸-3-亚油酸甘油酯(1，2-olein-3-linolein(rac)；货号：34-1827)、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯(1-palmitin-2-olein-3-linolein(rac)；货号：34-3012)、甘油三油酸酯(triolein(9c)；货号：33-1810)、1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯(1，2-olein-3-palmitin；货号：34-1821)、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯(1，2-olein-3-stearin(rac)；货号：34-1822) 均购于Larodan AB公司。

破壁灵芝孢子粉共21批，其中金华某中药饮片有限公司提供8批(批号为20120401、20120402、20120403、20100404、20120405、12121301、12121302和12121303)，市场购买各种品牌孢子粉饮片13批；未破壁灵芝孢子粉4批(批号为LQ-20111001、LQ-20111003、LQD-20111001、LQD-20111003)，产自浙江龙泉。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：ACCHROM Unitary-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-异丙醇(51:49)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；蒸发光散射检测器条件：漂移管温度105 ℃，载气流速2.0 L·min-1。

2.2 混合对照品溶液制备

精密称取各对照品适量，加乙腈-异丙醇(51:49) 制成含亚甘油三油酸酯、1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯、1，2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯、1，2-二油酸-3-亚油酸甘油酯、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯、甘油三油酸酯、1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯质量浓度分别为28.70、146.8、50.75、279.6、242.1、613.2、341.6、69.15 μg·mL-1的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

称取灵芝孢子粉0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈-异丙醇(51:49)25 mL，称量，水浴回流提取60 min，放冷，用乙腈-异丙醇(51:49) 补足减失的量，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液1、5、10、20、25、30 µL注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量(µg)的对数(X)为横坐标，峰面积的对数(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，并以最小二乘法计算得回归方程，见表 1；结果显示，亚甘油三油酸酯、1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯、1，2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯、1，2-二油酸-3-亚油酸甘油酯、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯、甘油三油酸酯、1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯进样量分别在0.028 70~0.861 0、0.146 8~4.404、0.050 75~1.523、0.279 6~8.388、0.242 1~7.263、0.613 2~18.40、0.341 6~10.25和0.069 15~2.075 µg范围内呈良好的线性关系。

表 1 8个成分线性关系考察结果 Table 1 Linear regression of 8 compounds
2.5 精密度试验

取同一份供试品溶液(样品批号12121302)，按上述色谱条件，连续进样6次，测定峰面积，结果灵芝孢子粉供试品溶液中8个成分峰面积的RSD均小于3.0%，表明方法精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取灵芝孢子粉样品(批号12121302)6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定峰面积并分别计算8个成分的含量。结果亚甘油三油酸酯平均含量为4.671 mg·g-1，RSD为3.6%；1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯平均含量为14.93 mg·g-1，RSD为2.1%；1，2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯平均含量为4.812 mg·g-1，RSD为4.7 %；1，2-二油酸-3-亚油酸甘油酯平均含量为40.73 mg·g-1，RSD为2.1%；1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯平均含量为23.77 mg·g-1，RSD为2.0%；甘油三油酸酯平均含量为57.03 mg·g-1，RSD为4.6%；1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯平均含量为95.90 mg·g-1，RSD为4.0%；1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯平均含量为16.55 mg·g-1，RSD为4.3%。

2.7 稳定性试验

按“2.3”项下方法制备灵芝孢子粉(批号12121302) 的供试品溶液1份，室温放置，分别在0、5.5、9、12.5、49 h时注入液相色谱仪，记录峰面积。结果显示，亚甘油三油酸酯、1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯、1，2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯、1，2-二油酸-3-亚油酸甘油酯、1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯、甘油三油酸酯、1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯峰面积的RSD分别为4.1%、2.3%、4.7%、2.5%、2.5%、4.0%、2.5%、2.3%，表明供试品溶液室温放置49 h稳定。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的灵芝孢子粉样品(批号12121302) 约0.08 g，一式6份，分别精密加入8个对照品的混合溶液适量，精密加入乙腈-异丙醇(51:49) 适量使总体积至10 mL，自“称量，水浴回流提取60 min”起，按“2.3”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积，计算平均回收率和RSD。结果显示8个成分的平均回收率在92.9%~104.1%，RSD在1.8%~4.6%之间，见表 2。

表 2 回收率试验结果(n=6) Table 2 Results of recovery
2.9 样品测定

取各样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液(同一样品一式2份)，按“2.1”项下色谱条件进行分析，见图 1。根据回归方程，计算各样品8个待测成分的含量，结果见表 3。

1.亚甘油三油酸酯(trilinolein) 2.1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯(1，2-linolein-3-olein) 3.1，2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯(1，2-linolein-3-palmitin) 4.1，2-二油酸-3-亚油酸甘油酯(1，2-olein-3-linolein) 5.1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯(1-palmitin-2-olein-3-linolein) 6.甘油三油酸酯(triolein) 7.1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯(1，2-olein-3-palmitin) 8.1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯(1，2-olein-3-stearin) 图 1 对照品(A)和灵芝孢子粉样品(B)的HPLC-ELSD色谱图 Figure 1 HPLC-ELSD chromatograms of reference substances(A)and sample of Ganoderma lucidum spore powder(B)

表 3 25批样品含量测定结果(mg·g-1) Table 3 The content of 8 compounds in 25 samples
3 讨论 3.1 检测器比较

因本品所测成分在紫外区基本无吸收，曾采用紫外检测器(205 nm作为检测波长)与ELSD串联进行检测，结果紫外检测器所测得的信号响应低且基线噪音大，而ELSD所得信号无论是峰形、响应及基线噪音均较UV法理想，故采用ELSD进行检测。

3.2 流动相比较

本研究比较了乙腈-二氯甲烷、甲醇-异丙醇、乙腈-异丙醇3不同的流动相系统，结果以乙腈-异丙醇(51:49) 等度洗脱时色谱分离最理想。

3.3 提取方法考察

本研究比较了石油醚(60~90 ℃)、乙腈-异丙醇(51:49) 不同提取溶剂，以及不同提取时间对含量的影响，结果显示采用乙腈-异丙醇(51:49) 溶液回流提取60 min含量最高。

3.4 耐用性试验

比较了不同柱温(25、30和35 ℃)、不同色谱柱(Agilent Zorbax SB-C18、Kromasil C18和ACCHROM Unitary-C18，规格均为(250 mm×4.6 mm，5 µm))对含量的影响，结果显示柱温及色谱柱对色谱峰的分离和油脂类成分的含量影响较小，表明本方法耐用性良好。

3.5 含量测定结果分析

未破壁的4批灵芝孢子粉(批号为LQ-20111001、LQ-20111003、LQD-20111001、LQD-20111003) 未能检测到8个待测成分，主要是由于被稳定的灵芝孢子壁包覆，有效成分不能被提取所致。本文采用HPLC-ELSD法同时测定了破壁灵芝孢子粉中8个油脂类成分的含量，该方法简便、重复性好，可为破壁灵芝孢子粉的质量评价提供依据。

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